ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパミン-2受容体に対する抗体を検出する
Summary
近年、生細胞ベースのアッセイは、表面とコンフォメーション抗原に対する抗体を検出するために首尾よく使用されている。ここでは、患者の大規模コホートの分析を可能にするフローサイトメトリーのハイスループット流を用いた方法を記載している。新規な抗体の検出は、免疫媒介性障害の診断および治療を改善する。
Abstract
近年、表面と神経伝達に関与コンフォメーションのタンパク質に対する抗体は、小児および成人における自己免疫CNS疾患で検出されている。これらの抗体は、診断および治療を導くために使用されてきた。細胞ベースのアッセイは、患者の血清中の抗体の検出を改善している。次いで、それらを蛍光標識二次抗体、続いて、希釈した患者血清と共にインキュベートし、真核細胞上の脳の抗原の表面発現に基づいている。洗浄後、二次抗体の結合を、フローサイトメトリーによって分析する。当社グループは、確実に特定の神経伝達物質受容体に対する抗体を検出するために、生きた細胞ベースのアッセイメトリーの高スループット·フローを開発しました。このフローサイトメトリー法が効率的で、単純で定量的であり、ハイスループットサンプラシステムの使用を容易に短期間でアッセイするために大きな患者コホートを可能にする。さらに、このようなセルベース回答が容易に中枢神経系及び末梢の両方から、多くの異なる抗原性標的に対する抗体を検出するように適合させることができる。追加の新規抗体のバイオマーカーを発見することは、迅速かつ正確な診断を可能にし、免疫介在性障害の治療を改善するであろう。
Introduction
近年、中枢神経系（CNS）自己免疫疾患の形態が同定されている。なお、これらの疾患が関連しており、自己抗体の存在によって定義されることが示されている。これらの抗体は、神経伝達を1,2に関わる神経細胞の受容体やシナプスのタンパク質に結合する。異なる抗原は、例えば、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDAR）3-5、γ-アミノ酪酸B受容体（GABAのB）受容体6、α-アミノ-3 -ヒドロキシ-5 -メチル-4 -として、検出されたイソキサゾール酸（AMPA）受容体7、電位依存性カリウムチャネル（VGKC）関連タンパク質：ロイシンリッチ神経膠活性化1タンパク質（LGL-1）およびコンタクチン関連タンパク質2（capsr2）8,9、グルタミン酸受容体5,10 、およびドーパミン2受容体（D2R）11。過去には、（主に脳炎と呼ばれる）これらの自己免疫CNS障害は、多くの場合、診断未確定と未処理だった。これらの新規抗体のバイオマーカー、 例えばNMDAR抗体又はD2R抗体は実質的に診断や意識を改善しているし、患者のための治療の選択肢を開いている。実際、免疫療法による早期治療が改善された結果11,12と関連している。
例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびウェスタンブロットなどの抗体を検出するための従来の方法は、血清中の抗体の検出のために使用されている。しかし、それらは容易に細胞外または表面エピトープの認識を有効にしないと、そうではなく、細胞内のエピトープに向けて免疫反応性を明らかにすることができる。さらに、神経伝達に関与する重要なタンパク質の細胞外ドメインに結合する抗体は、病原2,3,7,13,14である可能性が高い。このため、患者の関連する細胞表面や細胞外抗体の標的を発見するための正確で高感度なアッセイの開発が最も重要です。フィールドのゴールドスタンダード法は、いわゆる「細胞のBAの生細胞の使用に基づいているSED検定」。この方法は、哺乳動物細胞、目的の抗原の完全なcDNA配列を含有するベクターのトランスフェクションによるその天然の形態で（最も頻繁にヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞）の表面での抗原の発現を伴う。生きた非透過次いで、細胞を、希釈した患者血清と共にインキュベートし、蛍光色素結合抗ヒト免疫グロブリン（Ig）二次抗体が続く。蛍光の強度又はレベルが検出されると自己抗体結合のレベルに関連している。唯一の抗原が細胞内で過剰発現されているように、この技術は、特異的である。最も広く使用されている「読み出し」4,5,8-10を免疫細胞化学の後、共焦点顕微鏡分析している。しかしながら、細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーが正常に15-17脱髄疾患を有する患者において抗体を検出するために使用されている。特に、ウォーターズらは、15パンを用いた抗体の検出を比較し細胞ベースのアッセイを含む、抗体検出技術のエルは、顕微鏡検査またはフローサイトメトリーに続いて分析を流れ、そして最も敏感正確で、かつ信頼性の高い方法であることが、細胞ベースのアッセイフローサイトメトリーを示している。それは研究者に依存し、定量的ではなく、放射性物質のいずれかの使用を含まないように、したがって、細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーが有利である。それが大きな患者コホートが短時間でアッセイすることを可能にするようにも便利です。
より最近では、我々は、CNS自己免疫疾患を有する患者において11 NMDAR抗体及びD2R抗体を検出するための細胞ベースのアッセイフローサイトメトリーのハイスループットフローを最適化した。我々のグループは最近、細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーを用いて、患者血清中のNMDAR抗体を検出した。これらのNMDAR抗体陽性血清は、以前は、共焦点顕微鏡を用いて分析し、また、11陽性であった。このプロトコルは、Cの検出のための細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーの概要を説明自動化されたハイスループットサンプラーを用いた患者血清中のonformationに敏感な中枢神経系の抗体。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、高スループットのサンプラーを使用して、特定の細胞表面の神経タンパク質を標的とする抗体を検出するために、生きた細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーの新しいアプリケーションを記述します。この技術を用いて、自己免疫CNS疾患に罹患した患者のサブグループは、NMDARの表面又はD2Rに表面血清抗体を有することを報告している。
生細胞ベー…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、オーストラリア国立保健医療研究評議会、スター科学財団（オーストラリア）、トゥレット症候群協会（米国）によってサポートされていました、トリッシュ多発性硬化症研究財団および多発性硬化症の研究オーストラリア、この説明財団（オーストラリア）、レベッカL.クーパー医学研究財団（オーストラリア）。我々は我々の研究のためのサンプルを提供し、すべての患者や家族に感謝します。
Materials
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 |
Referências
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