High-throughput Flow Cytometry cellebasert analyse for å påvise antistoffer mot N-metyl-D-aspartat-reseptoren, eller dopamin-2-reseptor i Human Serum
Summary
I løpet av de siste årene, har levende celle-baserte analyser blitt brukt med hell for å påvise antistoffer mot overflaten og conformational antigener. Her beskriver vi en metode med høy gjennomstrømming flowcytometri muliggjør analyse av store årskull av pasienter. Detektering av nye antistoffer vil bedre diagnose og behandling av immunmedierte forstyrrelser.
Abstract
I løpet av de siste årene, har antistoffer mot overflaten og conformational proteiner involvert i nevrotransmisjon blitt oppdaget i autoimmune CNS sykdommer hos barn og voksne. Disse antistoffer er blitt benyttet til å lede diagnose og behandling. Celle-baserte analyser har forbedret påvisning av antistoffer i pasientens serum. De er basert på overflaten ekspresjon av hjerne antigener på eukaryotiske celler, som deretter inkubert med fortynnet pasientsera etterfulgt av fluorokromkonjugerte konjugerte sekundære antistoffer. Etter vasking, blir sekundært antistoff bindende deretter analysert ved strømningscytometri. Vår gruppe har utviklet en høy gjennomstrømning flowcytometri levende cellebaserte analysen til pålitelig oppdage antistoffer mot spesifikke nevrotransmitterreseptorer. Denne flowcytometri metoden er rett frem, kvantitativ, effektiv, og bruk av en high-throughput-sampler system muliggjør store pasientgruppene for å være lett analyseres i løpet av kort tid. I tillegg gir denne cellebasert isi lett kan tilpasses for å detektere antistoffer mot mange forskjellige antigene mål, både fra sentralnervesystemet og periferi. Oppdage flere romanen antistoff biomarkører vil muliggjøre rask og nøyaktig diagnose og bedre behandling av immunmedierte lidelser.
Introduction
Over de siste årene, har autoimmune former for sentralnervesystemet (CNS) sykdommer er identifisert. Det har vist seg at disse sykdommene er assosiert, og er definert ved tilstedeværelsen av autoantistoffer. Disse antistoffene binder til neuronale synaptiske reseptorer eller proteiner som er involvert i nevrotransmisjon 1,2. Forskjellige antigener er blitt detektert, for eksempel N-metyl-D-aspartat (NMDAR) 3-5, γ-aminosmørsyre B reseptor (GABA B) reseptor 6, α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4- isoksazolpropionsyre (AMPA) reseptoren 7, spenningsstyrte kaliumkanaler (VGKC) forbundet proteiner: leucin-rik glioma-aktivert protein 1 (LGL-1) og contactin-assosiert protein 2 (capsr2) 8,9, 5,10 glutamatreseptor og dopamin-2-reseptor (D2R) 11. I det siste, disse autoimmune forstyrrelser i sentralnervesystemet (hovedsakelig kalt encefalitt) var ofte udiagnostisert og ubehandlet. Disse nye antistoff biomarkører, f.eksNMDAR antistoff eller D2R antistoff, har gitt en kraftig forbedret diagnose og bevissthet, og har åpnet behandlingstilbud for pasientene. Faktisk er tidlig behandling med immunterapi assosiert med bedre utfall 11,12.
Tradisjonelle metoder for å påvise antistoffer, for eksempel enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) og western blot har blitt brukt for påvisning av antistoffer i sera. Men at de ikke lett å regnskaps av ekstracellulære eller overflate epitoper og, heller, kan avsløre immunoreaktivitets mot en intracellulær epitop. Videre antistoffer som binder til det ekstracellulære domenet av viktige proteiner som er involvert i nevrotransmisjon er sannsynlig å være patogene 2,3,7,13,14. Derfor er utvikling av nøyaktige og følsomme analyser for å finne relevant celleoverflaten eller ekstracellulære antistoff mål i pasienter akutt. Gullet standardmetoden i feltet er basert på bruken av levende celler, i såkalt "celle-based analyser ". Denne metoden involverer ekspresjon av et antigen på overflaten av pattedyrceller (oftest humane embryoniske nyre 293 (HEK293) celler) i sin opprinnelige form ved transfeksjon av vektorer inneholdende den fullstendige cDNA-sekvensen av antigenet av interesse. Aktive nonpermeabilized cellene blir deretter inkubert med fortynnet pasientens serum og fulgt av fluorkrom-konjugerte anti-humant immunoglobulin (Ig) sekundært antistoff. Intensiteten eller nivå av fluorescens blir så detektert og er forbundet til nivået av autoantistoffbinding. Denne teknikken er spesifikk, siden bare ett antigen er overuttrykt i celler. Den mest brukte "read-out" har vært konfokalmikroskopi analyse etter immunocytochemistry 4,5,8-10. Imidlertid strømningscytometri celle-baserte analyser har blitt brukt for å påvise antistoffer i pasienter med demyeliniserende sykdommer 15-17. Spesielt Waters et al. 15. lignet påvisning av antistoff ved hjelp av en panel av antistoff påvisningsteknikker, inkludert celle-baserte analyser, etterfulgt av mikroskopi eller strømningscytometri analyser, og har vist flowcytometri cellebasert assay for å være den mest følsom, nøyaktig og pålitelig måte. Derfor er flowcytometri cellebasert assay fordelaktig da det er kvantitativ, og ikke utprøver avhengig, og innebærer ikke noen bruk av radioaktivt materiale. Det er også fordelaktig da det gjør det mulig for store pasientgruppene som skal undersøkes i løpet av kort tid.
Mer nylig har vi optimalisert en high-throughput flowcytometri cellebasert assay for å påvise antistoff og NMDAR D2R antistoff hos pasienter med autoimmune sykdommer i sentralnervesystemet 11. Vår gruppe nylig oppdaget NMDAR-antistoff i pasientens sera ved hjelp av strømningscytometri cellebasert assay. Disse NMDAR-antistoff-positive sera, er tidligere analysert ved hjelp av konfokal mikroskopi og ble også funnet å være positive 11. Denne protokollen beskriver en flowcytometri cellebasert assay for påvisning av conformation-sensitive CNS antistoff i pasientens serum utnytte en automatisert høy gjennomstrømming sampler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette notatet beskriver en roman anvendelse av flowcytometri levende cellebasert analyse for å påvise antistoffer rettet mot bestemte celleoverflaten nevrale proteiner ved hjelp av en høy gjennomstrømming sampler. Ved hjelp av denne teknikken, rapporterer vi at en undergruppe av pasienter som lider av autoimmune CNS sykdommer har antistoffer til overflaten NMDAR eller til overflaten D2R.
Viktige trinn for optimal antistoffpåvisning ved hjelp av denne high-throughput flowcytometri levend…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av den australske National Health and Medical Research Council, Star Scientific Foundation (Australia), Tourettes syndrom Association (USA), The Trish Multippel sklerose Research Foundation og Multippel Sklerose Forskning Australia, Petre Foundation (Australia), Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australia). Vi takker alle pasienter og familiemedlemmer som følger prøver for vår studie.
Materials
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 |
Referências
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
