Долгосрочный Поведенческая Отслеживание свободно плавающих слабо электрических рыб
Summary
Мы описываем набор методов для изучения спонтанного поведения свободно плавающих слабо электрический рыбу в течение длительного периода времени, по синхронно измерения разряда электрический орган сроки животного, положение тела и осанку как точно и надежно в специально разработанной аквариума бака внутри сенсорной изоляция камеры.
Abstract
Долгосрочный поведенческая слежения может захватить и количественно природные поведения животных, в том числе те, которые происходят нечасто. Поведения, такие как разведка и социальных взаимодействий может быть лучше всего изучать, наблюдая необузданные, свободно ведут себя животные. Слабо электрическая рыба (ВЭФ) дисплей легко наблюдать разведочных и социального поведения, испуская электрический разряд органа (ПС). Здесь мы описываем три эффективных методов, чтобы синхронно измеряют EOD, положение тела и позу в свободное плавание ВЭФ в течение продолжительного периода времени. Во-первых, мы опишем построение экспериментальной бака внутри камере изоляции, призванной заблокировать внешние источники сенсорных стимулов, таких как свет, звук, и вибрации. Аквариум распределяли для размещения четырех испытательных образцов, и автоматизированные ворота дистанционно контролировать доступ животных к центральной арене. Во-вторых, мы описываем точный и надежный метод измерения ПС времени в режиме реального времени от свободно плавающих ВЭФ. Сигнальные искажения, вызванные движениями тела животного исправляются пространственного усреднения и височной стадии обработки. В-третьих, мы описываем подводную установку ближнего инфракрасного изображений наблюдать невозмущенные ночные поведения животных. Инфракрасные световые импульсы использовались для синхронизации времени между видео и физиологического сигнала в течение периода записи в длину. Наша автоматизированная программа отслеживания измеряет положение тела животного и позы надежно в водной сцене. В сочетании, эти методы позволяют долгосрочные наблюдения спонтанного поведения свободно плавающих слабо электрический рыбу в надежной и точной манере. Мы считаем, что наш метод может быть так же применяется к изучению других водных животных, соотнося свои физиологические сигналы с поисковых или социального поведения.
Introduction
История вопроса. Количественные эксперименты по поведению животных (например, вынужденный выбор, избегание шок, Т-лабиринт, и т.д..), Как правило, используются для расследования конкретных гипотез относительно навыков сенсорно-моторных, обучение и формирование памяти. Тем не менее, эти ограничительные эксперименты пропустить большую часть богатства естественного поведения животных и, вероятно, привести к упрощенным моделям основной нервной основе поведения. Опыты в более натуралистических условиях, следовательно, важным дополнением, по которому мы можем исследовать более полно вида поведения репертуар. Опыты с свободно движущихся животных, должны, однако, решения уникальных технических проблем, таких как движения, вызванной артефактов записи. В отличие от стимула, вызвали ответы, спонтанно происходит исследовательское поведение не может быть предсказано, таким образом испытуемые должны постоянно контролироваться и отслеживаться в течение длительного периода времени. Конкретные вопросы исследования чан, лучше всего осуществить с помощью тщательно отобранных организмов и доступных технических средств. Например, оптической записи и стимуляции методы, такие как генетически-кодированных датчиков кальция 1 и Optogenetics 2 были успешно применены свободно двигаться генетической модели организмов 3-5. Кроме того, миниатюрные нейронные системы телеметрии может записывать и стимулировать свободно перемещаться мелких животных 6,7.
Электрический рыбы. Виды ВЭФ генерировать разряды электрического органа (ЕСПЗ), которые позволяют им чувствовать свое непосредственное окружение или общаться на больших расстояниях. Временные закономерности ЕСПЗ отличаться в разных условиях, таких как самостоятельного движения 8,9, сенсорных стимулов 10,11 и социальных взаимодействий 12,13. Импульсного типа ВЭФ виды производят на поезд дискретных импульсов, в отличие видов махать типа, которые генерируют непрерывные квази-синусоидальной формы волны. В общем, пульс типа видов экспонат морэ переменная скорость ПС по сравнению с видами волна типа и EOD ставки животных точно отражать новизну содержимое своих сенсорных окрестностях 10,14. Видов импульсного типа можно сразу сократить интервал между импульса (IPI) в пределах одного цикла импульса в реагировать к новому сенсорной возмущения (новинка отклика 10,11,14). Продолжающийся электрический поведение этих рыб можно возмущается неконтролируемых сенсорных стимулов из внешних источников, и различные виды раздражителей, таких как вибрация, звук, свет, и свет, как известно запуска ответов новизны. Таким образом, особые меры предосторожности должны быть приняты, чтобы заблокировать или ослабить внешние сенсорные стимулы во время долгосрочного наблюдения свободное плавание ВЭФ. Таким образом, изменения в скорости EOD и траекторий движения может быть специально отнесены к стимулам, представленных экспериментатора.
Аквариум бак и изоляция камеры. Поэтому мы помещены несколько слоев Амортизирующая материалов уNDER большой аквариум бак (2,1 м х 2,1 м х 0,3 м), и окружили танк с изолированным корпусом блокировать внешние источники света, электрических помех, звук и теплового потока. ПС ставка зависит от температуры окружающей среды 15,16, при этом температура воды была жестко регулируется на тропический диапазоне (25 ± 1 ° С) для видов южноамериканских ВЭФ. Мы построили большой и мелкой (10 см глубина воды) бак для наблюдения пространственные разведочных поведения ВЭФ в основном ограничены в двух измерениях (рис. 1А). Танк был разделен на центральной арене, чтобы наблюдать пространственные поведения, и четырех угловых отсеков отдельно дом отдельных рыб (рис. 1В). Каждый отсек был построен водонепроницаемыми для предотвращения электрическую связь между физическими лицами. Доступ животных к центральной арене контролировалась извне четырех моторизованных ворот. Ворота были размещены между отсеками, и они стали водонепроницаемыми, когда закрываетсянейлоновыми крыла гаек. Нет металлические части были использованы подводные с ВЭФ чутко реагируют на металлы.
Запись ПС. ЕСПЗ генерируются в стереотипной манере активацией одного (в Mormyrids) или нескольких пространственно распределенных электрических органов (в Gymnotiforms) 17,18. Временные модуляции в скорости EOD может выявить нейронные деятельности более высокого уровня, так как мозговое кардиостимулятор получает прямые нервные сигналы от высших отделов головного мозга, таких как диэнцефального prepacemaker ядра, которое, в свою очередь получает аксональные прогнозы от переднего мозга 19. Однако сроки EOD должны быть тщательно экстрагируют из сырого сигнала записи, а не смещен движения искажений, вызванных животного. Электрическое поле порождается ВЭФ можно приблизить как диполь, поэтому EOD импульсные амплитуды на регистрирующих электродов зависят от относительных расстояний и направлений между животным и электродов 8,20. Самостоятельно MOVEM животногоЭнты изменить относительную геометрию между животным и электродами, при этом движения вызывают амплитуды EOD на различных электродов в изменяться с течением времени в летучем образом (см. фиг.2В в июне и соавт. 8). Кроме того, само-движения также изменить форму записанных EOD сигналов, потому что относительный вклад от другой набор электрических органов зависит от их расположения по длине тела и их местных кривизны введенной хвост изгиба. Искажения движения, вызванной в амплитуд и форм EOD может привести к неточных и ненадежных измерений временных EOD. Мы преодолели эти проблемы, пространственно среднем несколько сигналов EOD записанные в разных местах, и, добавив фильтр извлечения конверт точно определить время EOD из свободное плавание ВЭФ. Кроме того, наш метод также измеряет амплитуду EOD, которые указывают ли животное отдыхает или активно перемещения на основе изменения EODамплитуды с течением времени (см. рис 2E и 2F). Мы записали дифференциально усиленные сигналы от записи пар электродов для уменьшения синфазного шума. Поскольку импульсы EOD генерируются с нерегулярными интервалами времени, событие временных рядов ПС имеют переменную частоту дискретизации. EOD временные ряды могут быть преобразованы в постоянной частоты дискретизации посредством интерполяции, если этого требует аналитической инструмент выбора.
Запись видео. Хотя запись ПС может контролировать валовую двигательную активность животного, видеозапись позволяет прямые измерения положения тела животного и позы. Ближней инфракрасной области (БИК) освещение (λ = 800 ~ 900 нм) позволяет невозмущенную визуальное наблюдение свободно плавающих рыб 21,22, так как WEFs наиболее активны в темноте, и их глаза не чувствительны к NIR спектра 23,24. Большинство цифровых датчики изображения (например, CMOS или CCD) может захватить NIR спектр с wavelengtч Диапазон между 800-900 нм, после удаления Инфракрасный (ИК) блокирующий фильтр 25. Некоторые высокого класса потребительского класса веб-камеры предлагают высокой четкости, широкий угол обзора и хорошую низкой освещенности, который может производить качество изображения сравнимо с или выше профессионального уровня ИК камер, доступных на гораздо большие затраты. Кроме того, некоторые веб-камеры потребительского класса в комплекте с записи программного обеспечения, которое позволяет расширенную продолжительность записи путем сжатия видео без потери качества. Большинство профессионального уровня камеры предлагают времени синхронизации TTL импульсных выходов или TTL триггер импульсных входов 26 для выравнивания времени между видео с оцифрованных сигналов, но эта функция, как правило, отсутствует в потребительского класса веб-камер. Однако сроки между видеозаписи и сигнала цифровой преобразователь может быть точно подобраны по совместительству захвата периодически мигает ИК-подсветкой с камерой и сигнала цифрового преобразователя. Начальная и конечная сроки ИК импульса может использоватьсясек двух калибровочных время маркеры для преобразования числа видеокадров в единицу времени сигнал цифрового преобразователя и наоборот.
Освещение и фон. Захвата через воду изображение может быть технически сложным из-за отражения света на поверхности воды. Поверхность воды может действовать как зеркало, чтобы отразить визуальную сцену над водой, и темных визуальные особенности подводный, таким образом над водой сцена должна быть оказана невыразительный, чтобы предотвратить визуальный помех. Для того, чтобы изображение весь аквариум, камера должна быть размещены непосредственно над водой, и она должна быть скрыта за потолком над небольшим отверстием просмотра, чтобы предотвратить свое отражение на поверхности воды. Более того, поверхность воды может производить блики и неравномерного освещения, если источники света неправильно проецируется. Непрямое освещение может достичь равномерную яркость по всей аквариуме, нацеливая источники света к потолку, так что потолок и окружающая вальLs может отражать и рассеивают световые лучи, не достигнув поверхности воды. Выберите ИК-осветитель, который соответствует спектральной чувствительности камеры (например, 850 нм пик длины волны). Электрические помехи от источников света могут быть минимизированы с помощью светодиодов и размещения их источники питания постоянного тока за пределами клетки Фарадея. Поместите белый фон под баком, так как рыба контрастирует хорошо в белом фоне в ЧМР длин волн. Точно так же, использование матового белого цвета на внутренних поверхностях сурдокамере обеспечивает равномерное и яркое фоновую подсветку.
Отслеживания видео. После записи видео, автоматизированная алгоритм изображение слежения может измерять позиции и положения тела животного в течение долгого времени. Отслеживая видео может быть автоматически выполнена либо готового к использованию программного обеспечения (Точка зрения или Ethovision), или программируемой пользователем программного обеспечения (OpenCV или MATLAB Image Processing Toolbox). В качестве первого шага отслеживания изображения,действительный площадь слежения должна быть определена, рисуя геометрическую форму, чтобы исключить из нее часть снаружи (маскировки операцию). Далее, изображение животного должен быть изолирован от фона вычитанием фоновое изображение из изображения, содержащего животное. Вычитается изображение преобразуется в двоичном формате путем применения пороговой интенсивности, так что центр тяжести и осью ориентации может быть вычислена из бинарных морфологических операций. В Gymnotiforms 27-29 и Mormyrids 30-32, плотность electroreceptor является самым высоким вблизи области головы, поэтому положение головы в любой момент указывает местоположение самой высокой остроты слуха. Места головная и хвостовая может быть автоматически определяется путем применения операции поворот изображения и ограничительной рамки. Концы головы и хвоста можно было отличить друг от друга вручную определяя их в первом кадре, а также отслеживать их расположения от сравнения двух последовательных кадров.
Protocol
Representative Results
Discussion
Значение наших методов. Таким образом, мы впервые описал строительство большого аквариума бака и сурдокамере наблюдать спонтанные разведочных поведения произведенные ВЭФ. Далее, мы продемонстрировали технику записи и отслеживания скорости УВБ и государства движение от безудер?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была щедро поддерживается естественным наукам и инженерным исследовательского совета Канады (NSERC) и Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR).
Materials
| [Aquarium construction] | |||
| Electrically shielded floor heater | ThermoSoft Corp., IL, USA | ThermoTile | www.thermosoft.com |
| Tempered glass panel | generic | .5 inch thick, used for the aquarium construction | |
| Aquarium grade silicone | generic | ||
| Acrylic sheet | generic | .25 inch thick, matt white | |
| Natural rubber sheet | generic | .25 inch thick | |
| Servomotor | HITECHRCD Inc., Korea | HS-325HB, 180deg rotation | www.servocity.com |
| Servomotor arm mount | HITECHRCD Inc., Korea | 56362 Large Spline | www.servocity.com |
| Servomotor controller (6 chan.) | sparkfun.com | ROB-09664 | Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller |
| Active USB extension cable | C2G | 38990 | 12m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable |
| Exhaust fan | Nutone | ILFK120 | www.homedepot.com |
| Vertical aquarium filter | Tetra, Germany | Whisper Internal Power Filter – 40i | |
| Crushed coral | Used to increase the pH of the tank water | ||
| [EOD recording setup] | |||
| Graphite Electrodes | Staedtler, Germany | Mars Carbon 2-mm type HB | Shave the outer coating |
| Physiological Amplifier/Filter | Intronix, Canada | 2015F | |
| Coaxial Cable | generic | RG174 | For electrodes assembly |
| Coaxial Cable | generic | RG54 | For wiring use |
| BNC jack connector for RG-174 | Amphenol Connex | 112160 | For electrodes assembly |
| BNC plug connector for RG-54 | Amphenol Connex | 112116 | For wiring use |
| Signal digitizer hardware | Cambridge Electronic Design, UK | Power MKII 1401 | |
| Signal digitizer software | Cambridge Electronic Design, UK | Spike 2. ver 7 | |
| [Visual tracking setup] | |||
| White LED light | IKEA, Sweden | DIODER 201.194.18 | www.ikea.com |
| Infrared LED light (850 nm) | Scene Electronics, China | S8100-60-B/C-IR | Remove built-in fan |
| USB webcam | Logitech Inc., CA, USA | C910 | Remove Infrared blocking filter |
| Motorized camera | Logitech Inc., CA, USA | Quickcam Orbit | Remove Infrared blocking filter |
| Video recording software | Logitech Inc., CA, USA | Logitech Quickcam Software | Download from www.logitech.com |
| Matlab | Mathworks, MA, USA | 2012a | Image processing toolbox |
References
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., De Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
- Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nat. Neurosci. 13 (4), 513-520 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
- Mavoori, J., Millard, B., Longnion, J., Daniel, T., Diorio, C. A miniature implantable computer for functional electrical stimulation and recording of neuromuscular activity. In IEEE international workshop on biomedical circuits and systems (BioCAS) 2004; Session: Functional Electrical Stimulators and Related Sensing Techniques. , (2004).
- Harrison, R. R., Fotowat, H., Chan, R., Kier, R. J., Olberg, R., Leonardo, A., Gabbiani, F. Wireless neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE TBioCAS. 5 (2), 103-111 (2011).
- Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Precision measurement of electric organ discharge timing from freely moving weakly electric fish. J. Neurophys. 107 (7), 1996-2007 (2012).
- Forlim, C. G., Pinto, R. D. Noninvasive Realistic Stimulation/Recording of Freely Swimming Weakly Electric Fish: Movement Detection and Discharge Entropy to Infer Fish Behavior. , (2012).
- Caputi, A. A., Aguilera, P. A., Castelló, M. E. Probability and amplitude of novelty responses as a function of the change in contrast of the reafferent image in G. carapo. J. Exp. Biol. 206 (6), 999-1010 (2003).
- Pluta, S. R., Kawasaki, M. Multisensory enhancement of electromotor responses to a single moving object. J. Exp. Biol. 211 (18), 2919-2930 (2008).
- Heiligenberg, W. Electrolocation and jamming avoidance in a Hypopygus (Rhamphichthyidae, Gymnotoidei), an electric fish with pulse-type discharges. J. Comp. Phys. A. 91 (3), 223-240 (1974).
- Capurro, A., Malta, C. P. Noise autocorrelation and jamming avoidance performance in pulse type electric fish. Bull. Math. Biol. 66 (4), 885-905 (2004).
- Post, N., von der Emde, G. The “novelty response” in an electric fish: response properties and habituation. Phys. Behav. 68 (1), 115-128 (1999).
- Toerring, M. J., Serrier, J. Influence of water temperature on the electric organ discharge (EOD) of the weakly electric fish Marcusenius cyprinoides (Mormyridae). J. Exp. Biol. 74 (1), 133-150 (1978).
- Ardanaz, J. L., Silva, A., Macadar, O. Temperature sensitivity of the electric organ discharge waveform in Gymnotus carapo. J. Comp. Phys. A. 187 (11), 853-864 (2001).
- Rodríguez-Cattaneo, A., Pereira, A. C., Aguilera, P. A., Crampton, W. G., Caputi, A. A. Species-specific diversity of a fixed motor pattern: the electric organ discharge of Gymnotus. PLoS One. 3 (5), (2008).
- Bennett, M. V. L., Hoar, W. S., Randall, D. J. . Fish physiology. , 493-574 (1971).
- Wong, C. J. Afferent and efferent connections of the diencephalic prepacemaker nucleus in the weakly electric fish, Eigenmannia virescens: interactions between the electromotor system and the neuroendocrine axis. J. Comp. Neurol. 383 (1), 18-41 (1997).
- Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Real-time localization of moving dipole sources for tracking multiple free-swimming weakly electric fish. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Rasnow, B., Assad, C., Hartmann, M. J., Bower, J. M. Applications of multimedia computers and video mixing to neuroethology. J. Neuro. Methods. 76 (1), 83-91 (1997).
- MacIver, M. A., Nelson, M. E. Body modeling and model-based tracking for neuroethology. J. Neuro. Methods. 95 (2), 133-143 (2000).
- Douglas, R. H., Hawryshyn, C. W., Douglas, R., Djamgoz, M. . Behavioral studies of fish vision: an analysis of visual capabilities. In The Visual System of Fish. , 373-418 (1990).
- Ciali, S., Gordon, J., Moller, P. Spectral sensitivity of the weakly discharging electric fish Gnathonemus petersi using its electric organ discharges as the response measure. J. Fish Biol. 50 (5), 1074-1087 (1997).
- Ratledge, D. An Introduction to Webcam Imaging. Digital Astrophotography: The State of the Art. , 31-44 (2005).
- Hofmann, V., Sanguinetti-Scheck, J. I., Gómez-Sena, L., Engelmann, J. From static electric images to electric flow: Towards dynamic perceptual cues in active electroreception. J. Phys. Paris. 107, 95-106 (2013).
- Castelló, M. E., Aguilera, P. A., Trujillo-Cenóz, O., Caputi, A. A. Electroreception in Gymnotus carapo: pre-receptor processing and the distribution of electroreceptor types. J. Exp. Biol. 203 (21), 3279-3287 (2000).
- Caputi, A. A., Castelló, M. E., Aguilera, P., Trujillo-Cenóz, O. Electrolocation and electrocommunication in pulse gymnotids: signal carriers, pre-receptor mechanisms and the electrosensory mosaic. J. Phys. 96 (5), 493-505 (2002).
- Pusch, R., et al. Active sensing in a mormyrid fish: electric images and peripheral modifications of the signal carrier. J. Exp. Biol. 211 (6), 921-934 (2008).
- Harder, W. Die beziehungen zwischen elektrorezeptoren, elektrischem organ, seitenlinienorganen und nervensystem bei den Mormyridae (Teleostei, Pisces). Z. Vgl. Physiol. 59 (3), 272-318 (1968).
- Bacelo, J., Engelmann, J., Hollmann, M., Gvonder Emde, ., Grant, K. Functional foveae in an electrosensory system. J. Comp. Neurol. 511 (3), 342-359 (2008).
- Hollmann, M., Engelmann, J., Von Der Emde, G. Distribution, density and morphology of electroreceptor organs in mormyrid weakly electric fish: anatomical investigations of a receptor mosaic. J. Zool. 276 (2), 1469-7998 (2008).
- Knudsen, E. I. Spatial aspects of electric fields generated by weakly electric fish. J. Comp. Phys. 99 (2), 103-118 (1975).
- Kramer, B. Spontaneous discharge rhythms and social signalling in the weakly electric fish Pollimyrus isidori (Cuvier et Valenciennes) (Mormyridae, Teleostei). Behav. Ecol. Sociobiol. 4 (1), 66-74 (1978).
- Stoddard, P. K., Markham, M. R., Salazar, V. L., Allee, S. Circadian rhythms in electric waveform structure and rate in the electric fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Physiol. Behav. 90 (1), 11-20 (2007).
- Canfield, J. G. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
- Chen, L., House, J. L., Krahe, R., Nelson, M. E. Modeling signal and background components of electrosensory scenes. J. Comp. Physiol. A. 191 (4), 331-345 (2005).
- Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. E. A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities. J. Vis. Exp. (20), (2008).
- Windsor, S. P., Tan, D., Montgomery, J. C. Swimming kinematics and hydrodynamic imaging in the blind Mexican cave fish (Astyanax fasciatus). J. Exp. Biol. 211 (18), 2950-2959 (2008).
- Shapiro, L. G., Stockman, G. C. . Computer vision. , 367-368 (2001).
- Hedrick, T. L. Software techniques for two- and three-dimensional kinematic measurements of biological and biomimetic systems. Bioinsp. Biomim. 3 (3), 034001 (2001).
- Babineau, D., Lewis, J. E., Longtin, A. Spatial acuity and prey detection in weakly electric fish. PLoS Comp. Biol. 3 (3), (2007).
- Sanguinetti-Scheck, J. I., Pedraja, E. F., Cilleruelo, E., Migliaro, A., Aguilera, P., Caputi, A. A., Budelli, R. Fish geometry and electric organ discharge determine functional organization of the electrosensory epithelium. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Castello, M. E., Caputi, A., Trujillo‐Cenóz, O. Structural and functional aspects of the fast electrosensory pathway in the electrosensory lateral line lobe of the pulse fish Gymnotus carapo. J. Comp. Neurol. 401 (4), 549-563 (1998).
- Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Y. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1), 127-134 (2004).
- Pereira, A. C., Centurión, V., Caputi, A. A. Contextual effects of small environments on the electric images of objects and their brain evoked responses in weakly electric fish. J. Exp. Biol. 208 (5), 961-972 (2005).
