Summary

A lungo termine comportamentale inseguimento di Liberamente Nuoto debolmente elettrico Pesce

Published: March 06, 2014
doi:

Summary

Descriviamo un insieme di tecniche per studiare il comportamento spontaneo di nuotare liberamente pesci debolmente elettrica per un periodo prolungato di tempo, in modo sincrono i misurando temporizzazione di scarico organo elettrico dell'animale, la posizione del corpo e la postura sia preciso e affidabile in un acquario appositamente progettato all'interno di un sensoriale camera di isolamento.

Abstract

Monitoraggio del comportamento a lungo termine in grado di catturare e quantificare comportamenti animali naturali, comprese quelle che si verificano di rado. Comportamenti come l'esplorazione e le interazioni sociali possono essere meglio studiate osservando sfrenato, gli animali si comportano liberamente. Pesci elettrici debolmente (WEF) di visualizzazione esplorativa facilmente osservabili e comportamenti sociali emettendo organo scarica elettrica (EOD). Qui, descriviamo tre tecniche efficaci per misurare in modo sincrono la EOD, posizione del corpo, e la postura di un WEF nuoto libero per un periodo di tempo prolungato. In primo luogo, si descrive la costruzione di un serbatoio sperimentale all'interno di una camera di isolamento progettato per bloccare fonti esterne di stimoli sensoriali come luce, suono e vibrazioni. L'acquario è stato suddiviso per ospitare quattro provini e porte automatiche controllare a distanza l'accesso degli animali per l'arena centrale. In secondo luogo, si descrive un metodo di misurazione di temporizzazione EOD in tempo reale, preciso e affidabile da banche di nuoto WEF. Distorsioni di segnale causate dai movimenti del corpo dell'animale sono corretti da media spaziale e fasi di lavorazione temporali. In terzo luogo, si descrive una configurazione subacquea di imaging nel vicino infrarosso per osservare i comportamenti degli animali notturni imperturbati. Impulsi di luce infrarossa sono stati usati per sincronizzare la temporizzazione tra il video e il segnale fisiologico per una durata di registrazione lunghi. Il nostro software di monitoraggio automatizzato di misura la posizione del corpo dell'animale e la postura in modo affidabile in una scena acquatica. In combinazione, queste tecniche consentono osservazione lungo termine del comportamento spontaneo di nuotare liberamente pesci debolmente elettrica in modo affidabile e preciso. Crediamo che il nostro metodo può essere applicato in modo simile allo studio di altri animali acquatici rapportando loro segnali fisiologici con comportamenti esplorativi o sociali.

Introduction

Sfondo. Esperienze quantitative sul comportamento animale (ad esempio scelta forzata, shock evitamento, T-labirinto, ecc.) Sono tipicamente utilizzati per studiare ipotesi specifiche riguardanti le abilità senso-motorie, di apprendimento e di formazione della memoria. Tuttavia, questi esperimenti restrittive perdere gran parte della ricchezza del comportamento animale naturale e sono suscettibili di tradursi in modelli semplificate del sottostante basi neurali del comportamento. Esperimenti in condizioni più naturalistiche sono quindi un complemento importante con il quale possiamo esplorare più a fondo un repertorio comportamentale specie. Esperimenti su animali liberi di muoversi, tuttavia, devono affrontare sfide tecniche uniche come artefatti di registrazione indotti dal movimento. A differenza di risposte stimolo-evocato, che si verificano spontaneamente il comportamento esplorativo non può essere previsto; quindi soggetti sperimentali devono essere costantemente monitorati e tracciati per un periodo di tempo prolungato. Domande di ricerca specifiche can essere meglio affrontati da organismi accuratamente selezionati e gli strumenti tecnici disponibili. Ad esempio, la registrazione e la stimolazione tecniche ottiche come sensori di calcio geneticamente codificato 1 e optogenetics 2 sono state applicate con successo per muoversi liberamente organismi modello genetiche 3-5. In alternativa, sistemi di telemetria neurali miniaturizzati in grado di registrare e stimolare lo spostamento piccoli animali 6,7 liberamente.

Pesci elettrici. Specie WEF generano scariche elettriche organi (EOD), che consentono loro di percepire le loro immediate vicinanze o di comunicare su distanze maggiori. Pattern temporali di EOD variano in condizioni diverse, come auto-movimenti 8,9, stimoli sensoriali 10,11, 12,13 e le interazioni sociali. Pulse-specie tipo WEF producono un treno di impulsi discreti, a differenza delle specie di onda di tipo che generano forme d'onda quasi-sinusoidale continuo. In generale, di tipo impulsivo specie mostra more tasso variabile EOD rispetto alle specie d'onda di tipo e tassi EOD animali riflettere molto attentamente il contenuto della novità del loro ambiente sensoriali 10,14. Specie Pulse-tipo possono ridurre immediatamente l'intervallo tra impulsi (IPI) all'interno di un singolo ciclo di impulso in risposta a una perturbazione sensoriale romanzo (risposta novità 10,11,14). Il comportamento elettrico continuo di questi pesci può essere turbato da stimoli sensoriali incontrollate provenienti da fonti esterne, e diversi tipi di stimoli come vibrazione, suono, luce, e la luce sono noti risposte novità di trigger. Pertanto, speciali precauzioni devono essere adottate per bloccare o attenuare gli stimoli sensoriali esterni durante un'osservazione a lungo termine di nuotare liberamente WEF. In questo modo, variazioni della frequenza EOD e traiettorie di movimento possono essere specificamente attribuiti a stimoli presentati dallo sperimentatore.

Acquario serbatoio e camera di isolamento. Abbiamo quindi messo più strati di materiali ad assorbimento delle vibrazioni under un grande acquario (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), e circondato il serbatoio con un involucro isolante per bloccare le fonti esterne di luce, rumore elettrico, il suono e flusso di calore. Tasso EOD dipende dalla temperatura circostante 15,16, quindi la temperatura dell'acqua è strettamente regolata in un intervallo tropicale (25 ± 1 ° C) per le specie Sudamericana WEF. Abbiamo costruito un ampio e poco profondo (10 cm Profondità acqua) serbatoio per osservare i comportamenti esplorativi spaziali del WEF principalmente ristrette in due dimensioni (Figura 1A). Il serbatoio è stato ripartito in un'arena centrale di osservare i comportamenti spaziali, e quattro scomparti d'angolo per ospitare separatamente singoli pesci (Figura 1B). Ogni scompartimento è stato costruito a tenuta stagna per impedire la comunicazione elettrica tra gli individui. Accesso animali all'arena centrale è stato controllato dall'esterno da quattro porte motorizzate. I cancelli sono stati collocati tra i compartimenti, e divennero stagna quando è bloccatoda nylon ala-noci. L'assenza di parti metalliche sono stati usati sott'acqua dal WEF reagiscono sensibilmente ai metalli.

Registrazione EOD. EOD vengono generati in maniera stereotipata per l'attivazione di un singolo (in Mormiridi) o più organi elettrici spazialmente distribuiti (in Gymnotiforms) 17,18. Modulazioni temporali del tasso di EOD possono rivelare attività neurali di livello superiore, dal momento che il pacemaker midollare riceve gli input neurali diretti da regioni cerebrali superiori, come il nucleo prepacemaker diencefalica, che a sua volta riceve le proiezioni assonale dal prosencefalo 19. Tuttavia, i tempi EOD deve essere accuratamente estratta da una registrazione della forma d'onda prima e non polarizzato da distorsioni indotti dal movimento dell'animale. Il campo elettrico generato da un WEF può essere approssimato come un dipolo; quindi EOD ampiezze di impulso a elettrodi di registrazione dipendono dalle distanze relative e orientamenti tra l'animale e gli elettrodi 8,20. Self-movem di Animalgenitori cambiano la geometria relativa tra l'animale e gli elettrodi, così spostamenti causano le ampiezze EOD a diversi elettrodi a variare nel tempo in modo volatile (vedere la Figura 2B Giu et al. 8). Inoltre, l'auto-movimenti cambiano anche la forma delle forme d'onda registrate EOD, perché i contributi relativi da diverso insieme di organi elettrici dipendono dalle loro posizioni lungo la lunghezza del corpo e le loro curvature locali introdotta dalla coda flessione. Le distorsioni indotti dal movimento delle ampiezze e forme EOD possono portare a misure temporanee EOD imprecise e inaffidabili. Abbiamo superato questi problemi spazialmente media di forme d'onda multiple EOD registrate in luoghi diversi, e con l'aggiunta di un filtro di estrazione busta di determinare con precisione la tempistica EOD da un WEF nuotare liberamente. Inoltre, la nostra tecnica misura le ampiezze EOD, che indicano se un animale è a riposo o in movimento attivamente in base alla variazione della EODampiezze nel tempo (vedi figure 2E e 2F). Abbiamo registrato segnali differenziale amplificati dalle coppie di elettrodi di registrazione per ridurre il rumore di modo comune. Poiché gli impulsi EOD vengono generati a intervalli di tempo irregolari, l'evento time-series EOD hanno una frequenza di campionamento variabile. La serie temporale EOD può essere convertito in una frequenza di campionamento costante mediante interpolazione se richiesto da uno strumento analitico di scelta.

La registrazione del video. Sebbene la registrazione EOD può monitorare un'attività movimento lordo di un animale, registrazione video consente misurazioni dirette della posizione del corpo di un animale e la postura. Vicino infrarosso (NIR) illuminazione (λ = 800 ~ 900 nm) consente l'osservazione visiva imperturbabile di nuotare liberamente pesci 21,22, dal momento che WEFs sono più attivi nelle tenebre ei loro occhi non sono sensibili alle NIR dello spettro 23,24. La maggior parte dei sensori di immagini digitali (ad esempio, CMOS o CCD) in grado di acquisire spettro NIR con il wavelengtgamma h tra 800-900 nm, dopo aver rimosso una connessione a infrarossi (IR) bloccando il filtro 25. Alcuni webcam consumer di fascia alta offrono alta definizione, ampio angolo di visualizzazione e una buona sensibilità low-light, che può produrre una qualità d'immagine paragonabile o superiore al livello professionale telecamere IR disponibili a costi molto maggiori. Inoltre, alcune webcam consumer-grade sono in bundle con software di registrazione che permette una durata di registrazione esteso da comprimere il video senza perdita di qualità. La maggior parte delle fotocamere di livello professionale offrono sincronizzazione TTL uscite impulsi di tempo o ingressi impulsi TTL grilletto 26 per allineare i tempi tra il video con i segnali digitalizzati, ma questa caratteristica è generalmente assente in webcam consumer-grade. Tuttavia, i tempi tra una registrazione video e un digitalizzatore segnale può essere abbinato con precisione da concomitanza acquisizione di un IR periodicamente LED lampeggiante con la fotocamera e il digitalizzatore segnale. La sincronizzazione degli impulsi IR iniziale e finale può essere utilizzato uns due marcatori di calibrazione di tempo per convertire i numeri di fotogramma video l'unità di tempo segnale digitizer e viceversa.

Lighting & background. Cattura di immagini attraverso l'acqua può essere tecnicamente impegnativo a causa dei riflessi della luce sulla superficie dell'acqua. La superficie dell'acqua può agire come uno specchio per riflettere una scena visiva sopra l'acqua, e caratteristiche visive oscure subacqueo; quindi la scena di sopra dell'acqua deve essere reso featureless per evitare interferenza visiva. Per l'intera immagine acquario, una telecamera deve essere posizionato direttamente sopra l'acqua, e dovrebbe essere nascosto dietro il soffitto sopra un piccolo foro visualizzazione per impedire la sua riflessione sulla superficie dell'acqua. Inoltre, la superficie dell'acqua può produrre riflessi e illuminazione non uniforme se le sorgenti luminose sono proiettati in modo errato. Illuminazione indiretta può ottenere una luminosità uniforme su tutta acquario puntando le fonti di luce verso il soffitto, in modo tale che il soffitto e il wal circostantels può riflettere e diffondere i raggi di luce prima di raggiungere la superficie dell'acqua. Scegliere un illuminatore IR che corrisponde a una risposta spettrale della fotocamera (ad esempio 850 nm di lunghezza d'onda di picco). Il rumore elettrico dalle fonti di luce può essere minimizzato utilizzando luci a LED e piazzare i loro alimentatori in corrente continua al di fuori della gabbia di Faraday. Posizionare uno sfondo bianco sotto il serbatoio, dal pesce contrasta bene in uno sfondo bianco a lunghezze d'onda NIR. Analogamente, l'uso di colore bianco opaco sulle superfici interne della camera di isolamento fornisce uniforme e luminoso retroilluminazione.

Monitoraggio video. Dopo una registrazione video, un algoritmo di inseguimento automatico immagine può misurare posizioni e posture del corpo dell'animale nel tempo. Il monitoraggio video può essere eseguita automaticamente da una software pronto per l'uso (Viewpoint o Ethovision), o il software programmabile dall'utente (OpenCV o MATLAB Processing Toolbox Image). Come primo passo di inseguimento immagine,un'area inseguimento valido deve essere definito disegnando una forma geometrica di escludere l'area esterna (funzionamento mascheratura). Successivamente, l'immagine di un animale deve essere isolato dal contesto sottraendo un'immagine di sfondo da un'immagine contenente l'animale. L'immagine sottratta viene convertito in un formato binario applicando una soglia di intensità, in modo tale che il baricentro e l'asse di orientamento possono essere calcolate dalle operazioni morfologiche binarie. In Gymnotiforms 27-29 e 30-32 Mormiridi, la densità electroreceptor è il più alto vicino alla regione della testa, quindi la posizione della testa in qualsiasi momento, indica una posizione di massima acutezza sensoriale. Le posizioni di testa e di coda possono essere determinate automaticamente applicando le operazioni di rotazione dell'immagine e del riquadro di delimitazione. Le estremità di testa e di coda possono essere distinti l'uno dall'altro da essi definendo manualmente nel primo frame, e tenendo traccia delle rispettive posizioni dal confronto di due quadri successivi.

Protocol

Questa procedura è conforme ai requisiti della Università di Ottawa Comitato Animal Care. Nessun conflitto di interessi è dichiarato. Si prega di fare riferimento alla Tabella dei Materiali e reagenti per le marche e modelli di attrezzature e materiali elencati di seguito. Sono forniti scritte personalizzate Spike2 e MATLAB script e dati di esempio nel file supplementare. 1. Acquario serbatoio e isolamento Camera Setup Anti-v piano ibration. Costruire una superficie an…

Representative Results

Monitoraggio dei risultati EOD Le forme d'onda EOD registrate da diverse coppie di elettrodi varia in ampiezze e forme come previsto dalle loro posizioni uniche e orientamenti (Figura 2C alto). L'uso di più coppie di elettrodi assicurata forte ricezione del segnale a tutte le possibili posizioni e orientamenti del WEF all'interno del serbatoio. La forma d'onda busta (Figura 2C sotto, tracce verde) conteneva sempre un unico picco per ciclo EOD, …

Discussion

Importanza delle nostre tecniche. In sintesi, abbiamo prima descritto la costruzione di un grande acquario e una camera di isolamento per osservare i comportamenti esplorativi spontanee prodotte dal WEF. Successivamente, abbiamo dimostrato la tecnica di registrazione e il monitoraggio del tasso di EOD e gli stati di movimento dal pesce sfrenato in tempo reale utilizzando più coppie di elettrodi. Infine, abbiamo descritto la tecnica dell'infrarosso registrazione video attraverso l'acqua in modo sincroni…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato generosamente sostenuto dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC) e Canadian Institutes of Health Research (CIHR).

Materials

[Aquarium construction]
Electrically shielded floor heater ThermoSoft Corp., IL, USA ThermoTile www.thermosoft.com
Tempered glass panel generic .5 inch thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone generic
Acrylic sheet generic .25 inch thick, matt white
Natural rubber sheet generic .25 inch thick
Servomotor HITECHRCD Inc., Korea HS-325HB, 180deg rotation www.servocity.com
Servomotor arm mount HITECHRCD Inc., Korea 56362 Large Spline www.servocity.com
Servomotor controller (6 chan.) sparkfun.com ROB-09664 Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable C2G 38990 12m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan Nutone ILFK120 www.homedepot.com
Vertical aquarium filter Tetra, Germany Whisper Internal Power Filter – 40i
Crushed coral Used to increase the pH of the tank water
[EOD recording setup]
Graphite Electrodes Staedtler, Germany Mars Carbon 2-mm type HB Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter Intronix, Canada 2015F
Coaxial Cable generic RG174 For electrodes assembly
Coaxial Cable generic RG54 For wiring use
BNC jack connector for RG-174 Amphenol Connex 112160 For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54 Amphenol Connex 112116 For wiring use
Signal digitizer hardware Cambridge Electronic Design, UK Power MKII 1401
Signal digitizer software Cambridge Electronic Design, UK Spike 2. ver 7
[Visual tracking setup]
White LED light IKEA, Sweden DIODER 201.194.18 www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm) Scene Electronics, China S8100-60-B/C-IR Remove built-in fan
USB webcam Logitech Inc., CA, USA C910 Remove Infrared blocking filter
Motorized camera Logitech Inc., CA, USA Quickcam Orbit Remove Infrared blocking filter
Video recording software Logitech Inc., CA, USA Logitech Quickcam Software Download from www.logitech.com
Matlab Mathworks, MA, USA 2012a Image processing toolbox

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Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (85), e50962, doi:10.3791/50962 (2014).

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