Spremere cellulare come un robusto, Microfluidic intracellulare Delivery Platform
Summary
Rapida deformazione meccanica delle cellule è emerso come un metodo promettente, libero da vettori per la consegna intracellulare di macromolecole e dei nanomateriali. Questo protocollo fornisce la procedura dettagliata su come utilizzare il sistema per una vasta gamma di applicazioni.
Abstract
Rapida deformazione meccanica delle cellule è emerso come un metodo promettente, libero da vettori per la consegna intracellulare di macromolecole e dei nanomateriali. Questa tecnologia ha dimostrato il potenziale per affrontare applicazioni precedentemente impegnative, tra cui, la consegna alle cellule immunitarie primarie, riprogrammazione cellulare, nanotubi di carbonio, e la consegna quantum dot. Questa piattaforma microfluidica libero da vettori deduce rottura meccanica della membrana cellulare per facilitare la consegna citosolico del materiale bersaglio. Qui, si descrive il metodo dettagliato di uso per questi dispositivi microfluidici compresi, montaggio del dispositivo, preparazione cellulare, e il funzionamento del sistema. Questo approccio consegna richiede una breve ottimizzazione di tipo di dispositivo e le condizioni operative per le applicazioni precedentemente rimanere sconosciuti. Le istruzioni fornite sono generalizzabili alla maggior parte dei tipi di cellule e materiali di consegna in quanto questo sistema non richiede buffer specializzati o passi modificazione chimica / coniugazione. Questo lavoro fornisce anches raccomandazioni su come migliorare le prestazioni del dispositivo e problemi-shoot potenziali problematiche relative a intasamento, l'efficienza di consegna bassi, e la vitalità cellulare.
Introduction
Consegna delle macromolecole nel citoplasma delle cellule è un passo fondamentale in applicazioni terapeutiche e di ricerca. Nanoparticelle mediata consegna, per esempio, ha dimostrato una potenziale nella terapia genica 1,2, mentre la consegna proteina è un mezzo promettente di influenzare la funzione cellulare sia clinico 3 e 4 impostazioni di laboratorio. Altri materiali, come ad esempio farmaci a piccole molecole, i punti quantici, o nanoparticelle d'oro, sono di interesse in applicazioni che vanno dal cancro terapeutica 5,6 all'etichettatura intracellulare 7,8 e singola molecola di monitoraggio 9.
La membrana cellulare è sostanzialmente impermeabile alle macromolecole. Molte tecniche esistenti utilizzano nanoparticelle polimeriche 10,11, liposomi 12 o modificazioni chimiche 13 per facilitare rottura della membrana o la consegna intracellulare. In questi metodi, la vitalità efficienza consegna e cellulari sono spesso dipendente dalla struttura del secoloe molecola target e il tipo di cella. Questi metodi possono essere efficaci nella fornitura di materiali di struttura uniforme, come acidi nucleici, ma spesso sono poco adatti per la consegna dei materiali più strutturalmente diverse, come le proteine 14,15 e nanomateriali 7. Inoltre, il meccanismo di interruzione endosome che la maggior parte di questi metodi si basano su è spesso inefficiente, lasciando quindi molto materiale intrappolato in strutture vescicole 16. Infine, i metodi che sono spesso sviluppati per essere utilizzati con linee cellulari stabilizzate non si traducono bene alle cellule primarie.
Metodi di membrana all'incorporazione, come elettroporazione 17,18 e sonoporazione 19, sono una valida alternativa in alcune applicazioni, tuttavia, sono noti per causare la vitalità cellulare bassi e possono essere limitate dal responsabile del materiale consegna bersaglio.
Rapida deformazione meccanica delle cellule, un approccio microfluidica alla consegna, ha recentemente demonstrated suoi vantaggi rispetto alle tecniche attuali nel contesto di riprogrammazione cellulare 20 e consegna nanomaterial 21. Questo metodo si basa sulla distruzione meccanica o la membrana cellulare per facilitare la consegna citosolico dei materiali presenti nel buffer circostante. Il sistema ha dimostrato che consenta potenziale in precedenza sfidare tipi di cellule (ad esempio cellule immunitarie primarie e cellule staminali) e materiali (ad esempio anticorpi e nanotubi di carbonio). Qui, la procedura generale di utilizzare questi dispositivi per la consegna intracellulare di macromolecole bersaglio è descritto. La procedura è generalizzabile a maggior parte dei tipi di cellule e materiali di consegna, tuttavia, è consigliabile una condurre una breve ottimizzazione delle condizioni, come descritto nelle nostre linee guida progettuali precedentemente segnalati 20, per tutte le applicazioni precedentemente non. Ad oggi, il sistema è stato usato con successo per la consegna di RNA, DNA, nanoparticelle di oro, punti quantici, i nanotubi di carbonio, proteines, e polimeri destrano 20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Taluni aspetti della procedura sperimentale descritta (cioè fattori diversi progettazione di chip e velocità operativa) possono avere bisogno di essere ottimizzato a seconda del tipo di cellula e materiale consegna il sistema viene applicato. La discussione che segue indirizzi alcuni dei fattori più comuni da considerare quando si progetta esperimenti.
Per migliorare il segnale di consegna per i composti fluorescente, si ha la necessità di affrontare le fonti di fluorescenza di …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo T. Shatova per l'utile discussione sul design sperimentale e analisi dei dati. L'assistenza e la competenza di G. Paradis, il personale della citometria a flusso principale presso l'Istituto Koch, e il personale della Microsystems Technology Laboratory presso il Massachusetts Institute of Technology sono riconosciuti con gratitudine. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Grants RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, e in parte dal National Cancer Institute Cancer Center Support (Core) concede P30-CA14051 e MPP-09Call-Langer-60.
Materials
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
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