Presser cellule comme, microfluidique Delivery Platform intracellulaire robuste
Summary
Déformation mécanique rapide des cellules a émergé comme une méthode prometteuse, indemne de vecteurs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules et des nanomatériaux. Ce protocole fournit des instructions détaillées sur la façon d'utiliser le système pour une large gamme d'applications.
Abstract
Déformation mécanique rapide des cellules a émergé comme une méthode prometteuse, indemne de vecteurs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules et des nanomatériaux. Cette technologie a démontré un potentiel dans le traitement des demandes auparavant difficiles, y compris, la livraison de cellules primaires du système immunitaire, la reprogrammation cellulaire, nanotubes de carbone, et la prestation de point quantique. Cette plate-forme microfluidique indemne de vecteurs repose sur une rupture mécanique de la membrane de la cellule pour faciliter la délivrance cytosolique de la matière cible. Nous décrivons ici la méthode détaillée de l'utilisation de ces dispositifs microfluidiques, y compris, le montage du dispositif, de la préparation cellulaire, et le fonctionnement du système. Cette approche de livraison nécessite un bref optimisation du type d'appareil et les conditions d'exploitation pour les applications non signalés précédemment. Les instructions fournies sont généralisables à la plupart des types de cellules et des matières de livraison, ce système ne nécessite pas des tampons spécialisés ou des étapes de modification chimique / d'orthographe. Ce travail permet également des des recommandations sur la façon d'améliorer les performances de l'appareil et dépanner les problèmes potentiels liés à l'obstruction, l'efficacité de la prestation faibles, et la viabilité cellulaire.
Introduction
Délivrance de macromolécules vers le cytoplasme de la cellule est une étape critique dans les applications thérapeutiques et de recherche. Nanoparticules médiation livraison, par exemple, a montré un potentiel en thérapie génique 1,2, tandis que la prestation de protéine est un moyen prometteur d'affecter la fonction cellulaire à la fois clinique et de laboratoire 3 4 paramètres. D'autres matériaux, tels que les médicaments à petites molécules, des points quantiques, ou des nanoparticules d'or, sont d'un intérêt dans des applications allant de la thérapeutique du cancer de 5,6 à 7,8 marquage intracellulaire, et seule molécule de suivi 9.
La membrane cellulaire est en grande partie imperméable aux macromolécules. De nombreuses techniques existantes utilisent des nanoparticules polymériques 10,11 liposomes 12, ou des modifications chimiques 13 à faciliter la rupture de la membrane ou de la livraison d'endocytose. Dans ces procédés, l'efficacité d'administration et de la viabilité des cellules est souvent dépendante de la structure de the molécule cible et du type de cellule. Ces méthodes peuvent être efficaces à la livraison de produits de structure uniforme, tels que les acides nucléiques, mais sont souvent mal adaptés pour la livraison de plus structurellement divers matériaux, tels que les protéines et les nanomatériaux 14,15 7. En outre, le mécanisme de rupture d'endosome que la plupart de ces méthodes s'appuient sur est souvent inefficace, cela laisse donc beaucoup de matériel piégé dans les structures vésiculaires 16. Enfin, les méthodes qui sont souvent développés pour une utilisation avec des lignées cellulaires établies ne se traduisent pas bien de cellules primaires.
Membrane de poration méthodes telles que l'électroporation, 17,18 et 19 sonoporation, sont une alternative intéressante dans certaines applications, mais ils sont connus pour provoquer une faible viabilité des cellules et peut être limitée par la charge du matériau de fourniture de cible.
Déformation mécanique rapide des cellules, une approche microfluidique à la livraison, a récemment demonstrés ses avantages par rapport aux techniques actuelles, dans le contexte de la reprogrammation de la cellule 20 et la livraison de nanomatériau 21. Cette méthode repose sur la rupture mécanique o la membrane de la cellule pour faciliter la délivrance cytosolique de matériaux présents dans le tampon environnant. Le système a démontré un potentiel permettant de contester auparavant types de cellules (cellules immunitaires primaires et les cellules souches par exemple) et les matériaux (par exemple des anticorps et des nanotubes de carbone). Ici, le mode opératoire général d'utiliser ces dispositifs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules cibles est décrite. La procédure est généralisable à la plupart des types de cellules et de matériaux de livraison, mais il est recommandé que l'on mener une brève optimisation des conditions, comme indiqué dans nos directives de conception signalés précédemment 20, pour les applications non signalés précédemment. A ce jour, le système a été utilisé avec succès pour la fourniture de l'ARN, de l'ADN, des nanoparticules d'or, des points quantiques, des nanotubes de carbone, des protéiness, et des polymères de dextrane 20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Peuvent avoir besoin d'être optimisé en fonction du type cellulaire et de matériau de libération du système est appliqué à certains aspects de la procédure expérimentale décrite (à savoir les facteurs autres que la conception de la puce et de la vitesse de fonctionnement). La discussion qui suit aborde certaines des facteurs les plus communs à considérer lors de la conception des expériences.
Pour améliorer le signal de livraison pour les composés marqués par fl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions T. Shatova de discussion utile sur la conception expérimentale et l'analyse de données. L'assistance et l'expertise de G. Paradis, le personnel de la cytométrie de flux noyau à l'Institut Koch, et le personnel du Laboratoire de la technologie Microsystems au Massachusetts Institute of Technology grandement appréciée. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de subventions à la santé RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, et en partie par l'Institut national du cancer Cancer Center de soutien (de base) Subventions P30-CA14051 et député-09Call-Langer-60.
Materials
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
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