Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas
Summary
Descrevem-se os métodos de imagiologia que usamos para investigar a distribuição e a mobilidade das proteínas fluorescentes transfectadas residentes no retículo endoplasmático (ER), por meio da imagem confocal de células vivas. Também analisamos ultraestruturalmente o efeito de sua expressão na arquitetura deste compartimento subcelular.
Abstract
Os lípidos e proteínas em células eucarióticas são continuamente trocadas entre compartimentos celulares, embora estas mantêm a sua composição distinta e funções apesar do tráfego intenso interorganelle molecular. As técnicas descritas neste documento são poderosos meios de estudar proteínas e lipídios e mobilidade tráfico in vivo e em seu ambiente fisiológico. Recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em fotodegradação (FLIP) são amplamente usadas técnicas de imagem em células vivas, para estudar o tráfico intracelular através da via endocítica-exo, a continuidade entre a organelos ou subcompartimentos, a formação de complexos de proteína, e proteína de localização em microdomínios lipídicos, todos os quais podem ser observados sob condições fisiológicas e patológicas. As limitações destas abordagens são principalmente devidos à utilização de proteínas de fusão fluorescentes, e as suas desvantagens potenciais incluem artefatual sobre-expressoíon nas células ea possibilidade de diferenças na dobradura e localização de proteínas marcadas e nativas. Finalmente, como o limite de resolução do microscópio óptico (cerca de 200 nm) não permite a investigação da estrutura fina do ER ou os subcompartimentos específicos que podem se originar nas células sob estresse (ie hipóxia, a administração da droga, a expressão excessiva de transmembrana proteínas residentes ER) ou em condições patológicas, combinamos de imagem de células vivas de células transfectadas cultivadas com ultraestrutural análises baseadas em microscopia eletrônica de transmissão.
Introduction
A descoberta da proteína verde fluorescente (GFP) e suas variantes espectrais, eo desenvolvimento paralelo de microscopia de fluorescência, abriram totalmente novos caminhos para a investigação do comportamento de proteínas nas células. Técnicas como a recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em fotodegradação (FLIP), que é possível por causa da capacidade intrínseca de fluoróforos para extinguir a fluorescência, sob iluminação intensa, são baseados em imagens ao vivo de células confocal e o uso de transf As proteínas de fusão fluorescentes 1-3. Eles são amplamente utilizados para avaliar não só a localização de proteínas, mas também a sua mobilidade e transporte vesicular, o que pode revelar pistas importantes sobre a sua função 4.
A característica única de células eucarióticas é a presença de compartimentos intracelulares que têm composições de lípidos e de proteínas específicas. Embora organelas são fisicamente isolaed, eles precisam de se comunicar uns com os outros e partes componentes moleculares a fim de manter a homeostase celular. A via secretora garante que as proteínas e lípidos sintetizados no ER chegar ao destino final correcta em que exercem a sua função. Organelas intracelulares também pode ser conectado por sites de contacto dinâmicos que permitem que as moléculas (lipídios) a serem trocadas diretamente entre os compartimentos. Além disso, muitas proteínas têm de montados em grandes complexos heteroméricos ou associada com as espécies de lípidos específicos (jangadas lipídicas / microdomínios), a fim de se tornar funcionalmente activa ou pode ser transportado para o seu destino final. Todos estes aspectos biológicos influenciam grandemente as propriedades cinéticas das proteínas, e podem, portanto, ser adequadamente investigada por meio das técnicas descritas a seguir.
Nosso grupo tem utilizado FRAP e FLIP combinado com microscopia eletrônica, a fim de estudar a arquitetura do ER e seus diferentes subdomínios. O ER é a primeira estação da via secretora e desempenha um papel chave na proteína e lípido de classificação 5. É uma organela altamente dinâmico cujos subdomínios distintos refletem suas muitas funções diferentes (ou seja, proteínas e biossíntese de lipídios e de tráfico, dobradura de proteínas, Ca 2 + armazenamento e liberação, e do metabolismo de xenobióticos). No entanto, embora sejam morfologicamente, espacialmente e funcionalmente distinto, estes domínios são contínuas umas com as outras, e a sua abundância relativa pode ser modificado em células em condições fisiológicas e patológicas. O mais conhecido e domínios geralmente espacialmente segregadas do ER são o envelope nuclear, eo RE liso e áspero, no entanto, nós e outros demonstraram que há estruturas de ER, com uma arquitetura mais elaborada e organização tridimensional em vários tipos de células e tecidos sob condições fisiológicas que podem ser induzidas por meio de estímulos de stress, tais como a hipoxia, a drogaadministração, ou a sobre-expressão de proteínas de transmembrana ER residente 2,6 (e suas referências).
Também se demonstrou recentemente a presença de tais estruturas em modelos celulares de doenças humanas 1,7. Originário da cisternas empilhadas de RE liso, eles receberam o nome coletivo de organizado retículo endoplasmático liso (OSER), em 2003, 6, embora eles também são conhecidos como karmellae, lamelas e cristalóide ER com base em sua arquitetura que, como seu tamanho, pode variar. Depois as células são transfectadas com GFP fundida com a região citosólica de proteínas de ER-residente (TA) (d EGFP-ER) ancorada-cauda, a tendência fracamente dimerização de GFP em trans altera drasticamente a organização e estrutura do ER. FRAP e FLIP experimentos mostraram que d EGFP-ER é livre para difundir dentro OSERs, eo fato de que ela se move a partir da ER reticular ao OSER e vice-versa </ Em> indica que os agregados são contínuas com o ER reticular circundante. Análise ultraestrutural nos permitiu correlacionar os dados de fluorescência com uma descrição detalhada da arquitetura OSER e organização em escala nanométrica: OSERs são sempre composta de pilhas de cisternas emparelhado de RE liso, mas pode ter diferentes formas de organização espacial, como regularmente organizadas sinusoidal arrays ou espirais, ou hexagonais "cristalóides" matrizes tubulares. Estes rearranjos levar a morfologias cúbicos 8 que, como eles foram encontrados em células em condições fisiológicas e 9 seguintes stress como a hipóxia 10, o tratamento de droga 11, e cancro 9, podem ter um potencial significativo como marcadores de ultra-estruturais.
Após esta primeira demonstração utilizando proteínas de fusão de GFP, foram utilizadas experiências de imagiologia para analisar a proliferação de domínios de ER, em resposta aos tratamentos farmacológicos 12, assess a tendência de proteínas fluorescentes para oligomerise nas células 13, e para investigar o papel de um mutante, proteína TA ALS-linked na formação de agregados intracelulares de origem ER que podem ser relevantes para a sua patogenicidade a 1,8. Tem sido sugerido que a formação de agregados intracelulares (que ocorre em muitas doenças neurodegenerativas, 14) pode ser um mecanismo de protecção concebido para evitar que as interacções entre proteínas mutantes tóxicos e os componentes celulares circundantes 15.
O que se segue é uma descrição de uma combinação de métodos de microscopia óptica e eletrônica para investigar construções cujo C-terminal domínios hidrofóbicos são inseridos na membrana do ER, e uma análise de seu comportamento dinâmico e os efeitos de sua sobre-expressão no domínio ER Arquitectura em células em cultura (ver Figura 1 para um fluxograma do protocolo experimental).
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos e abordagens de imagem descritos neste trabalho foram utilizados para investigar a distribuição e mobilidade das proteínas fluorescentes TA transfectadas residentes no ER de células vivas. Analisamos também o efeito da expressão sobre-destas proteínas na arquitetura deste compartimento subcelular por meio de análises ultra-estruturais.
A combinação de células vivas de imagem confocal e microscopia eletrônica representa é um poderoso meio de investigar as propriedad…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são gratos a Fondazione Filarete por sua ajuda e apoio na publicação deste artigo. Gostaríamos também de agradecer Centro Europeo di Nanomedicina para o uso do Tecnai G2 microscópio eletrônico de transmissão.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldehyde Grade I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Osmium Tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Science | 19150 | |
| Uranyl Acetate dihydrate | Sigma Aldrich | 73943 | slightly radioactive |
| Propylene Oxide | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| EPON embedding medium kit | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Lead Citrate | Electron Microscopy Science | 17800 | |
| Bench top centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 Microscope Cage Incubation System | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 ° | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| steel culture cell chamber for 24 mm coverslip | Bioscience Tools | CSC-25 | |
| Electron Microscopy grids | Electron Microscopy Science | G300Cu |
Referências
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