Um Procedimento para Implantação de Arrays organizado de microfios para gravações a única unidade em Awake, comportando-se Animais
Summary
Implantar matrizes organizados de microfios para utilização em gravações eletrofisiológicas unitárias apresenta uma série de desafios técnicos. Métodos para a realização desta técnica e os equipamentos necessários são descritos. Além disso, discute-se o uso benéfico de matrizes microfios organizados para gravar a partir de sub-regiões neurais distintos, com alta seletividade espacial.
Abstract
Em gravações eletrofisiológicas vivo no acordado, comportando animais fornecem um método poderoso para a compreensão da sinalização neural ao nível de uma única célula. A técnica permite que pesquisadores para examinar temporal e regionalmente padrões de disparo específicas, a fim de correlacionar os potenciais de ação gravadas com o comportamento em curso. Além disso, as gravações unitárias podem ser combinados com uma infinidade de outras técnicas, a fim de produzir explicações abrangentes da função neural. Neste artigo, descrevemos a anestesia e preparação para a implantação microfio. Posteriormente, enumerar os equipamentos necessários e passos cirúrgicos para inserir de forma precisa uma matriz microfio em uma estrutura alvo. Por fim, descrevemos brevemente o equipamento usado para gravar a partir de cada eletrodo individual na matriz. Os conjuntos de microfios fixos descritos são bem adaptados para a implantação crónica e permitir a gravação de dados longitudinais neurais em quase qualquer preparati comportamentaisna. Discutimos traçando trilhas de eletrodos para triangular as posições microfios, bem como maneiras de combinar implantação microfio com técnicas de imuno-histoquímica, a fim de aumentar a especificidade anatómica dos resultados gravados.
Introduction
Registros eletrofisiológicos permitirá aos cientistas estudar as propriedades elétricas das células biológicas. No sistema nervoso central, onde impulsos elétricos servir como um mecanismo de sinalização, essas gravações são de particular importância para a compreensão da função neural 1-2. Durante as gravações unitárias em comportando animais, um microeletrodo que foi inserido no cérebro é capaz de registrar as mudanças na geração de um neurônio de potenciais de ação ao longo do tempo.
Embora muitas técnicas permitem gravar a atividade cerebral, unidade única eletrofisiologia é um dos métodos mais precisos, permitindo resolução no nível neurônio único. Quando um elevado grau de especificidade espacial é desejada, microfios pode ser usado para atingir ou núcleos sub-conjuntos de células dentro do brain3 discretas. Gravações de uma única Unidade também se beneficiam com alta resolução temporal como gravações são precisos ao nível do microssegundo. E, in vivo agravações vigília permitir interações circuito intactas, com o meio natural de aferentes e eferentes projeções, química sistêmica e influências hormonais e parâmetros fisiológicos. Os sinais neurais são derivados de entrada sensorial, comportamentos motores, o processamento cognitivo, neuroquímica / farmacologia, ou alguma combinação. Assim, a segregação de sensoriais, motoras, cognitivas e químicos influências exige experiências bem concebidas com contingências e controles eficazes que podem permitir a avaliação de cada uma das influências acima mencionadas. Ao todo, as gravações em animais se comportando permitir experimentadores para observar a integração de múltiplas fontes de informação dentro de um circuito em funcionamento e para derivar um modelo mais abrangente de função do circuito.
Gravações de uma única Unidade também sofrem de uma série de desvantagens do que qualquer pesquisador deve estar ciente. Em primeiro lugar, as gravações podem ser difíceis de realizar. De facto, as propriedades de the amplificadores headstage e os microfios implantados que permitem a especificidade espacial e temporal nessas gravações também faz gravações suscetíveis à influência de sinais elétricos estranhas (ou seja, "ruído" elétrico). Assim, a capacidade de resolver problemas em um sistema eletrofisiológico exige uma compreensão técnica dos princípios e aparelhos eletrofisiológicos bem desenvolvida. É também importante notar que, em certas circunstâncias, os sinais eléctricos registados em gravações extracelulares podem representar a soma de vários sinais neurais. Além disso, a generalização de actividade de uma única unidade de actividade da população de uma região alvo muitas vezes pode ser limitada pelo grau de heterogeneidade celular dentro da região alvo (mas ver Cardin 4). Por exemplo, os eléctrodos podem ser inclinados para a gravação de neurónios de saída de grande amplitude no lugar de outras células. A interpretação das gravações unitárias é aumentadacombinando gravações com outras técnicas, incluindo, mas não limitado a, eléctrico (ortodrômica ou antidrômica), estimulação química (por exemplo, iontoforese ou receptor designer) ou optogenetic 4, inativações neurais temporários, exames sensório-motores 5, os procedimentos de desconexão, ou imuno-histoquímica 3.
No protocolo que se segue, enumerar os materiais e as medidas necessárias para implantar uma matriz microfio organizado no rato (embora o protocolo pode ser adaptado para o uso em outras espécies). O procedimento e estilo de matrizes fixos utilizados em nosso laboratório têm demonstrado confiança para gravações longitudinais e pode sustentar gravações do mesmo neurônio para ao longo do tempo de um mês 6-8. Isso faz com que este procedimento ideal para examinar as respostas fásicas aos estímulos experimentais, mudanças plásticas nas respostas neurais, ou mecanismos de aprendizagem e motivação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gravações extracelulares representam uma técnica experimental poderosa que pode ser incorporado em quase qualquer preparação experimental em neurociência. Os fios que foram implantados em matrizes organizados pode ser rastreada como os seus veios passam através do cérebro e para a sua zona alvo (Figura 5A). Quando uma lesão pequena, pós-experimental é criada na ponta microfio não isolados para criar um pequeno depósito de ferro a partir do fio de aço inoxidável, pode-se marcar com precis?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado pelo Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas concede DA 006.886 (MOW) e DA 032.270 (DJB).
Materials
| Table 1. List of Surgical Materials | |||
| Gauze | Fisher (MooreBrand) | 19-898-144 | |
| Cotton Swabs | Fisher (Puritan) | S304659 | |
| Nembutal (Pentobarbital) | Sigma Aldrich | P3761 | |
| Atropine Methyl Nitrate | Sigma Aldrich | A0382 | |
| Baytril (Enrofloxacin) | Butler Shein (Bayer) | 1040007 | |
| Ketamine Hydrochloride | Butler Shein | SKU# 023061 | |
| Betadine (Povidone-Iodine) | Fisher (Perdue) | 19-066452 | |
| Stereotax | Kopf | Model 900 | |
| Cauterizing Tool | Stoelting | 59017 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ445 | |
| Dental Drill | Buffalo | 37800 | |
| Bacteriostatic Saline | Bulter Schein | 8973 | |
| Jewlers Skrews | Stoelting | 51457 | |
| Microwire Array | Microprobes | Custom (Flexible) | |
| Ground Wire | Omnetics | Custom Plug | |
| Dental Acrylic | Fisher (BAS) | 50-854-402 | |
| Absorbable Sutures | Fisher (Ethicon) | NC0258473 | |
| Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant) | Fisher (Henry Schein) | 008897 |
| Table 2. List of Surgical Instruments | |||
| 2x Microforceps | George Tiemann & Co. | #160-57 | Multi-use (e.g. clearing debris in skull window) |
| 2x Forceps | George Tiemann & Co. | #160-93 | Multi-use (e.g. tying sutures) |
| 6x Hemostats | George Tiemann & Co. | #105-1125 | Clamp and open incision |
| 1x Small scissors | George Tiemann & Co. | #105-411 | Cut sutures after tying |
| 1x Tissue forceps | George Tiemann & Co. | #105-222 | Holding tissue while suturing |
| 1x Needle holder | George Tiemann & Co. | #105-1259 | Holding suture needle |
| 1x Scalpel holder (with #11 blade) | George Tiemann & Co. | #105-80 (w/ #105-71 blade) | Making skull incision |
| 1x # 22 Scalpel blade | George Tiemann & Co. | # 160-381 | Shaving scalp |
| 1x Surgical Spatula | George Tiemann & Co. | #160-718 | Scraping skull to clear tissue on skull |
| Machine/Jewelers Screws | Various | N/A | 0/80 x 1/8” |
| Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals | |||
| Microwire Array & Connector | Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD) | N/A | Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc. |
| (Part No. Based on array characteristics) | |||
| Unity-Gain Harness/Headstage | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1200 | Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals. |
| Commutator (& Optional Fluid Swivel) | Plastics One, Inc. (Roanoke, VA) | SL18C | Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp |
| Pre-Amplifier | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1198 | Differentially amplifies neural signals against a reference electrode. |
| Filter & Amplifier | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1199 | Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal. |
| Acquisition Computer | EnGen (Phoenix, AZ) | N/A (Custom Build) | Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition. |
| A/D Card | Data Translation (Marlboro, MA) | DT-3010 | Digitizes neural signals for computer sampling. |
| Digital I/O Card | Measurement Computing (Norton, MA) | PCI CTR-05 | Acquires behavioral inputs and outputs |
Referências
- Carter, M., Shieh, J. C. . Electrophysiology In: Guide to research techniques in neuroscience. , (2009).
- Aston-Jones, G., Siggins, G. R., Kupfer, D., Bloom, F. E. . Electrophysiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. , (1995).
- Root, D. H., et al. Differential roles of ventral pallidum subregions during cocaine self-administration behaviors. J. Comp. Neurol. 521 (3), 558-588 (2013).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. (3-4), 106-103 (2012).
- Ma, S., et al. Amphetamine’s dose-dependent effects on dorsolateral striatum sensorimotor neuron firing. Behav. Brain Res. , (2013).
- Ghitza, U. E., et al. Persistent cue-evoked activity of accumbens neurons after prolonged abstinence from self-administered cocaine. J. Neurosci. 23 (19), 7239-7245 (2003).
- Tang, C., et al. Changes in activity of the striatum during formation of a motor habit. Eur. J. Neurosci. 25 (4), 1212-1227 (2007).
- Tang, C., et al. Dose and rate-dependent effects of cocaine on striatal firing related to licking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 324 (2), 701-713 (2008).
- . National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , (2011).
- Fabbricatore, A. T., et al. Electrophysiological evidence of mediolateral functional dichotomy in the rat accumbens during cocaine self-administration: tonic firing patterns. Eur. J. Neurosci. 30 (12), 2387-2400 (2009).
- Root, D. H., et al. Slow phasic and tonic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 66 (2), 106-127 (2012).
- Root, D. H., et al. Rapid-phasic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 64 (9), 704-713 (2010).
- Tang, C. C., et al. Decreased firing of striatal neurons related to licking during acquisition and overtraining of a licking task. J. Neurosci. 29 (44), 12952-12961 .
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
