In Vivo microscopie à deux photons de terminaisons nerveuses dans la peau simples
Summary
Le protocole pour l'imagerie dynamique longitudinale et lésion laser sélectif de terminaisons nerveuses chez des souris transgéniques reporter est présente.
Abstract
Les terminaisons nerveuses de la peau sont impliqués dans des processus physiologiques tels que la détection d'une aussi dans des processus pathologiques tels que la douleur neuropathique 2. Leur positionnement proche de la surface facilite l'imagerie microscopique de terminaisons nerveuses de la peau chez l'animal intact vivant. En utilisant la microscopie multiphotonique, il est possible d'obtenir des images fines à surmonter le problème de la forte dispersion de la lumière du tissu cutané. Reporter souris transgéniques qui expriment EYFP sous le contrôle de Thy-1 promoteur dans les neurones (y compris la périphérie des neurones sensoriels) sont bien adaptés pour les études longitudinales de chaque terminaisons nerveuses sur des périodes de temps prolongées jusqu'à plusieurs mois, voire toute une vie. En outre, en utilisant le même laser femtoseconde comme pour l'imagerie, il est possible de produire des lésions hautement sélectifs des fibres nerveuses pour les études de la restructuration de fibres nerveuses. Ici, nous présentons un protocole simple et fiable pour multiphotonique longitudinale en imagerie in vivo etmicrochirurgie au laser sur la souris terminaisons nerveuses de la peau.
Introduction
Terminaisons nerveuses cutanées subissent des changements dynamiques sous différents états physiopathologiques. Les fibres nerveuses peuvent passer par le processus de dégénérescence et de régénération ou de restructuration dans le cadre de maladies telles que la neuropathie périphérique 2 ou Morton neurinome 3. Après un traumatisme, une partie importante de terminaisons nerveuses dynamique dans la peau est réinnervation de la zone endommagée. Cependant, l'approche commune pour enquêter sur les terminaisons nerveuses est ex vivo histologique sectionnement qui manque d'informations en temps réel sur les processus en cours 4. En utilisant des marqueurs fluorescents génétiquement codés, il est possible de suivre les terminaisons nerveuses de la peau d'animaux vivants, obtenant ainsi une information riche et beaucoup plus pertinentes sur les changements structurels. L'étude des terminaisons nerveuses cutanées est possible en utilisant la microscopie à fluorescence classique, cependant, la forte dispersion de la lumière du tissu cutané compromet fortement la qualitédes données acquises 5. La microscopie multiphotonique permet l'acquisition d'images à haute résolution dans les tissus fortement de diffusion en raison de la somme non-linéaire de l'énergie des photons de lumière d'excitation résultant des émissions de fluorescence seulement du point focal de l'objectif. Cet effet conduit à une forte augmentation de la profondeur de pénétration et une amélioration de rapport signal sur bruit de la mesure, dans les tissus de la peau 6. En utilisant le même laser pour l'imagerie, il est possible de produire dissection sélective des fibres nerveuses 7. Dans le protocole suivant, nous montrons le procédé d'imagerie longitudinal de terminaisons nerveuses cutanées in vivo dans des souris transgéniques reporter associé à une lésion sélective au laser disponible dans le commerce en utilisant le système de microscope multiphotonique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole vidéo, nous démontrons le procédé de formation d'image longitudinal à deux photons non-invasive de terminaisons nerveuses individuelles.
La dynamique de l'innervation de la peau est affectée dans des maladies telles que le psoriasis et la neuropathie périphérique 2, et dans les lésions traumatiques 9. L'imagerie à deux photons permet une analyse détaillée des structures de fibres nerveuses dans la matrice de collagène. L'ut…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Neurotar Ltd pour l'assistance technique, la Fondation de la CIMO et FGSN d'un soutien financier.
Materials
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight) | |
| Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS | |||
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1ml | BD | 300013 | |
| 30G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchaized from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water imersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
Referências
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Wu, K. K. Morton’s interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
- Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
- Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062 (2010).
- Sacconi, L., O’Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
- Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
- Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats. Mol Pain. 7, 63 (2011).
- Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).
