इन विट्रो सेल प्रवास और आक्रमण assays में
Summary
आमतौर पर इस्तेमाल किया, इन विट्रो में सेल प्रवास और आक्रमण की जांच के लिए अत्यधिक सुलभ तरीके से वर्णित हैं. पहली विधि सेल गतिशीलता उपाय है कि सेल घाव बंद परख है. दूसरी विधि chemotactic और कोशिकाओं के आक्रामक क्षमता का आकलन है कि transwell प्रवास और आक्रमण परख है.
Abstract
Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.
Introduction
गतिशीलता जीवित कोशिकाओं का एक अनिवार्य विशेषता है. सेल प्रवास जीवन, भ्रूण विकास, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है, और इस तरह के कैंसर मेटास्टेसिस और सूजन 1-9 के रूप में कई रोग प्रक्रियाओं की अवधारणा में शामिल है. इसलिए, सेल प्रवासी व्यवहार का अध्ययन करने के तरीकों जैव चिकित्सा विज्ञान, जीव विज्ञान, जैव अभियांत्रिकी, और संबंधित क्षेत्रों में विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए बहुत उपयोगी अनुसंधान उपकरण हैं.
कैंसर रोगियों में मृत्यु का मुख्य कारण metastatic प्रगति से संबंधित है के रूप में कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में सेल प्रवास के अध्ययन विशेष रुचि का है. पूरे शरीर में फैल गया और प्रसार करने के लिए कैंसर के लिए आदेश में, कैंसर कोशिकाओं को विस्थापित करना होगा और intravasate रक्त परिसंचरण में, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के माध्यम से आक्रमण, दूर के एक साइट के लिए देते हैं, और अंत में दूर foci 1,10-12 के लिए फार्म का बहना. विभिन्न जैविक विधियों विस्तार में इन घटनाओं का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. सेल संस्कृति घाव बंद एकडी transwell प्रवास और आक्रमण assays व्यापक रूप से वैज्ञानिक समुदाय 1,10 में उपयोग किया जाता है. इन परीक्षणों के लिए एक विशेष सेल प्रकार अनायास विस्थापित या एक chemo-attractant का जवाब और directionally यह की ओर पलायन कर सकते हैं कितनी अच्छी तरह का एक समझने के लिए अनुमति दे सकता है कि आवश्यक डेटा प्रदान कर सकते हैं. कई प्रवासी phenotypes वर्णित किया गया है. कोशिकाओं mesenchymal या अमीबाभ तरह आंदोलन में या 13 स्ट्रीमिंग सामूहिक प्रवास या सेल लेबल बहुकोशिकीय आंदोलन से देखा जैसे किसी एकल कक्ष के रूप में विस्थापित हो सकते हैं. चलता – फिरता कोशिकाओं में इस्तेमाल आंदोलन की विधि आसानी से सेल संस्कृति घाव बंद परख का उपयोग कर देखा जा सकता है.
सेल प्रवास अध्ययन करने के लिए कई तरीके के अलावा, सेल घाव बंद परख सरलतम में से एक है. इस विधि पूरे सेल जनता के प्रवास क्षमता निर्धारित करने के लिए उपयोगी है. एक कदम आगे ले लिया जब यह माइग्रेशन 14 के दौरान व्यक्तिगत सेल के लक्षण निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. घाव बंद के विश्लेषण के बाद कई phenotypes से पता चला जा सकता है. एक नियंत्रण करने के लिए जब तुलना में समय के साथ बंद दूरी को मापने के विशिष्ट प्रवास परिवर्तन या पहले से अनजान था कि एक भ्रष्ट प्रवासी फेनोटाइप प्रकट हो सकता है. इसके अलावा, एकल कक्ष lamellipodium गठन, पूंछ त्याग, और दिशात्मक आंदोलन ब्याज 14 की कोशिकाओं में बिगड़ा या बढ़ाया जा सकता है के लिए सुराग दे सकता है.
transwell प्रवास और आक्रमण assays directionally वे chemokines, वृद्धि कारक है, लिपिड, या nucleotides 4,5,8,15,16 हैं कि क्या विभिन्न chemo-attractants का जवाब करने के लिए एकल कक्षों की क्षमता का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह भी कारण एक रिसेप्टर 1,14 से अधिक अभिव्यक्ति के लिए अंतर प्रवासी क्षमता का आकलन हो सकता है. ये assays भी इस तरह के छोटे GTPases 2 का रो परिवार के रूप में सेल प्रवास के प्रमुख नियामकों की पहचान और विशेषताएँ इस्तेमाल किया जा सकता है. Acces आसानी से इन छोटी और निम्नलिखितsible परीक्षण, सेल प्रवास के मोड और एक 3 डी मैट्रिक्स में आक्रमण करने के लिए एक सेल की क्षमता भी निर्धारित किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
सेल प्रवास कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू है और यह भी, विकास प्रतिरक्षाविज्ञानी और घाव भरने के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है. सेल संस्कृति बंद करने परख घाव और tran…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mike Myles, Sam Saunders, and C.W. Elton at the ECU Multimedia & Technology Services for providing assistance in video production. We acknowledge the grant support from North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association, and ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. and M.J.R.).
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Dissolved in water at 0.2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalog number varies depending on the type of culture plate |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalog number varies depending on the pore size of the membrane |
Referências
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