Os métodos para isolar e preparar amostras de testículos de Drosophila (ao vivo e fixo) para geração de imagens por contraste de fase e microscopia de fluorescência são descritos aqui.
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Artigo de método
Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Drosophila melanogaster é um poderoso sistema modelo que tem sido amplamente utilizado para elucidar de uma variedade de processos biológicos. Por exemplo, estudos, tanto do sexo feminino e as linhas germinativas masculinas de Drosophila têm contribuído grandemente para a compreensão atual da meiose, bem como a biologia de células-tronco. Excelente protocolos estão disponíveis na literatura para o isolamento e imagiologia de ovários e testículos 3-12 Drosophila. Aqui, os métodos para a dissecação e preparação de testes de Drosophila para análise microscópica são descritos com uma demonstração em vídeo que o acompanha. Um protocolo para o isolamento de testículos do abdómen de adultos do sexo masculino e preparar as lâminas de tecido vivo, para análise por microscopia de contraste de fase, bem como o protocolo para a fixação e imunocoloração testículos para análise por microscopia de fluorescência são apresentados. Estas técnicas podem ser aplicadas na caracterização de mutantes de Drosophila que exibem defects na espermatogénese, assim como na visualização de localizações subcelulares de proteínas.
Introdução
Testículos de Drosophila são um sistema modelo ideal para o estudo de muitos processos biológicos incluindo a regulação das células estaminais, a meiose, e desenvolvimento do esperma 13-18. Os espermatócitos e os seus fusos meióticos são grandes e, portanto, conveniente para análise citológica e relaxado checkpoints do ciclo celular durante a espermatogênese facilitar o estudo de mutações em genes do ciclo celular. Diferentes tipos de células pode ser observada na progressão ordenada ao longo do comprimento dos testículos, e qualquer interrupção da espermatogénese pode conduzir a alterações neste arranjo global. Estas características combinadas co....
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Protocolo
1. Testes Dissection
- Anestesiar moscas em uma garrafa ou frasco, usando um fluxo de CO 2 e transferir para uma almofada de mosca.
- Ordenar opera sob um microscópio de dissecação com um pequeno pincel, e recolher um número apropriado (dependendo do ensaio) de Drosophila, os machos dos genótipos desejáveis. Jovens do sexo masculino (0-2 dias de idade) são ideais para examinar as células ao longo das etapas anteriores da espermatogênese (por exemplo, espermatogônias, espermatócitos e espermátides iniciais pós-meióticas), enquanto que os homens um pouco mais velhos (2-5 dias de idade) são ideais para examinar células nos e....
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Resultados
Um exemplo de um par adequadamente dissecados dos órgãos reprodutores masculinos de Drosophila é mostrado na Figura 2A. Testículos do abdómen da mosca adulta masculina está normalmente ligado ao ducto ejaculatório (castanho, Figura 2A ') e um par de glândulas acessórias (verde, Figura 2A'), através de um par de vesículas seminais (azul, Figura 2A ') . Para separar os testículos da maioria do tecido somático que o acompanha, o ducto .......
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Discussão
Embora os testículos de moscas do tipo selvagem pode ser facilmente identificado, devido à sua cor amarela (em contraste, os tecidos brancos vizinhos), os testículos de moscas mutantes brancos são brancos e, assim, eventualmente, pode ser confundido com o intestino. Mais estirpes transgénicas, que são tipicamente num fundo branco, também têm testículos branco porque o mini-gene de branco encontrada em P-elementos não promove a acumulação de pigmentos nos testículos. Quando os testícul.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Michael Anderson para a criação em laboratório Lee estes métodos aceitos para estudar espermatogênese com aconselhamento especializado de Karen Hales. H. Oda e Y. Akiyama-Oda generosamente forneceu a γ-tubulina-GFP voar estoque. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NIH R01 para LAL (GM074044).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | Elastômero de silicone de duas partes para fazer prato de dissecação revestido de silicone da placa de Petri Kimax |
| Caneta PAP | Fisher Scientific | NC9888126 | Ted Pella #22309 |
| Protetor de unhas transparente | Wet n Wild | ||
| ProLong Gold com DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Anticorpo anti-gama-tubulina de camundongo (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-003 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Etanol | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
| Metanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 16% Formaldeído | Thermo Fisher Scientific | 28908 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | Use de acordo com as instruções do fabricante para siliconizar lamínulas |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D-9542 | 0,5 mg / ml em etanol a 75%; armazene a -20 ° C |
| NaCl | Research Products International Corp. | S23020 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Limpadores de tarefas delicadas Fisher | Scientific | S47299 | |
| BSA | Research Products International Corp. | A30075 | |
| Frasco de coloração Coplin de vidro | Microscopia Eletrônica Ciências | 70315 | |
| Lâminas de microscópio fosco simples | Corning | 2948-75X25 | |
| Poli-L-lisina revestida lâminas | de microscópio Polysciences, Inc. | 22247-1 | Opcional (para substituir lâminas de microscópio não tratadas) |
| Vidro de cobertura quadrado | Corning | 2865-22 | |
| Lâminas de barbear | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Kimax Placa de Petri | Fisher Scientific | S31473 | Kimble #23060 10015 Pinça EMD |
| Dumont | 52100-51S | Padrão 5 INOX | |
| Stemi 2000-CS estereoscópio | Carl Zeiss | ||
| Eclipse 80i | Nikon | ||
| Objetiva Plan-Fluor 40X | Nikon | ||
| Axiophot | Carl Zeiss | ||
| Plan-Neofluar Ph2 40X objetiva | Carl Zeiss |
Referências
- McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Bonacc....
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Reimpressões e permissões
