정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비<em> 초파리</em> 고환
Summary
분리 및 위상 콘트라스트와 형광 현미경으로 이미징 초파리 고환 샘플 (생활하고 고정)을 제조하는 방법이 설명된다.
Abstract
초파리 melanogaster의 널리 생물학적 과정의 다양성을 설명하기 위해 사용 된 강력한 모델 시스템이다. 예를 들어, 여성과 초파리의 수컷 생식 라인 모두의 연구는 현재의 감수 분열에 대한 이해뿐만 아니라 줄기 세포 생물학에 크게 기여했다. 우수한 프로토콜은 초파리의 난소와 고환 3-12의 분리 및 이미징에 대한 문헌에서 사용할 수 있습니다. 여기서, 현미경 분석에 대한 해부와 초파리 고환의 제조 방법은 첨부 된 비디오 데모와 함께 설명되어 있습니다. 성인 남성의 복부에서 고환을 분리하고 위상차 현미경에 의한 분석뿐만 아니라 형광 현미경에 의한 분석을 위해 고환을 고정하고 면역 염색을위한 프로토콜에 대한 살아있는 조직 슬라이드를 제조하는 프로토콜이 제공됩니다. 이러한 기술 개발을 나타내는 초파리 돌연변이의 특성에 적용 할 수있다정자뿐만 아니라 단백질의 세포 내 현지화의 시각화 EFECTS.
Introduction
초파리의 고환은 줄기 세포의 조절, 세포의 감수 분열, 그리고 정자 개발 13-18 등 많은 생물 학적 과정의 연구를위한 이상적인 모델 시스템이다. 정모 세포와 그들의 감수 스핀들 대형 및 세포 학적 분석에 따라서 편리하고 편안한 정자 동안에 세포주기 체크 포인트는 세포주기 유전자 변이의 연구를 용이하게한다. 상이한 세포 유형은 고환의 길이를 따라 정렬 된 진행성에서 관찰 될 수 있고, 정자 형성에 어떠한 중단이 전반적인 배열의 변화로 이어질 수있다. 초파리의 유전 도구와 결합 된 이러한 기능은 정자 21-23의 돌연변이 분석을 용이하게했다.
초파리의 정자의 단계가 잘 정의되어 있습니다. 낭종 내에 동기 개발 생식선 세포는 고환의 길이를 따라 정자의 단계를 통해 순차적으로 진행. 보 중유사 분열과 남성 생식 세포의 감수 분열 번째, 세포질 분열은 딸 세포 (그림 1) 링 운하로 알려진 세포질 다리로 연결되어있는 것을 불완전 같은 발생합니다. 고환의 꼭대기 끝은 차 정모 세포의 16 셀 낭종을 생성하는 불완전한 세포질 분열 네 개의 유사 분열 분열을 거쳐 정원 세포에 상승을 제공 생식 줄기 세포의 인구가 포함되어 있습니다. premeiotic S 단계 후, 차 정모 세포는 G2 ~ 90 시간하는 세포 부피가 증가 ~ 25 배 동안의 장기 성장 기간을 입력합니다. 감수 분열의 I 각각 차 정모 세포와 반수체 정자의 64 세포 낭종, 32 셀 낭종의 형성 세포의 감수 분열 II 결과를 통해 진행 상황. 미숙 한, 둥근 정자 성숙 정자를 형성하기 위해 광범위한 세포 리모델링을 받고있다. 사후 감수 세포는 연신의 번들 및 성숙 정자 특히, 고환의 볼륨을 중시 점유한다.
티여성 파리에 기능 정자의 그는 성공적으로 전송 여러 쌍 구조 (고환, 정낭 및 액세서리 땀샘)과 하나의 사정관으로 구성되어 남성의 생식 시스템 (그림 2)의 다른 부분 간의 조정이 필요합니다. 정자는 고환에서 생산 교미 24까지 정낭에 저장됩니다. 액세서리 샘은 정액을 생산하는 분비 세포가 포함되어 있습니다. 정낭에서 이주 정자가 정낭 및 액세서리 분비 모두 연결된 사정관, 내 정액과 혼합된다. 정자와 정액의이 혼합물은 궁극적으로 여성의 남성의 복부 (25)의 후방 단부에 위치 사정 전구를 통해 비행의 질에 남성의 펌핑된다. 정액 내 단백질은 담당자에 spermathecae로 알려진 전문 기관 내에서 정자의 장기간 보관에 필수적인초파리 암컷 26 roductive 기관.
초파리 고환의 분리 및 정자의 여러 단계에서 세포의 시각화를위한 훌륭한 방법은 과학 문헌 3-12에서 사용할 수 있습니다. 우리는 여기에 첨부 된 비디오 데모와 함께 이러한 프로토콜의 예를 제시하여 지식이 몸에 추가합니다. 위상차 현미경 라이브 고환 샘플의 준비를위한 프로토콜은 앞에서 설명한 방법 (27)에 기초한다. 포름 알데히드 고정 및 고환의 면역 염색을위한 프로토콜은 이전에 설명한 방법 28을 기반으로합니다. 본원에 기재된 방법 (예를 들어, 초파리 정자 동안, 마이너스 엔드 – 지향의 미세 소관 모터 dynein의 역할을 평가하기 위해) 초파리 정자의 많은 연구에 사용되었다.
기본 프로토콜 이외에, 제안은 varyin 제공된다G 해부 정조 세포, 정모 세포, 또는 성숙한 정자 풍부하게하기 위해. 이러한 낭종이 고환을 처리하기위한 다른 방법은 그대로 유지 또는 설명되어 필요에 따라 중단됩니다 하나. 모델 시스템으로 초파리 고환 사용에 장점은 초파리 난자 및 배아에 비해 항체 및 염료 쉽게 고환에서 그들의 분산 다음 세포에 침투 할 수 있으며, 적은 세척 단계가 요구되는 점이다, 따라서, 프로토콜은 상대적으로 수행 될 수있다 짧은 시간.
Protocol
Representative Results
Discussion
야생형 파리의 고환은 쉽게 인해 노란색 (대조적으로 이웃 흰색 조직)을 식별 할 수 있지만, 흰색 돌연변이 체의 고환은 흰색이며, 따라서 가끔 용기와 혼동 할 수 있습니다. P 요소에있는 미니 흰색 유전자가 고환에있는 색소의 축적을 촉진하지 않기 때문에 흰색 배경에 전형적으로 대부분의 형질 전환 균주는 또한 흰색 고환이 있습니다. 초파리의 고환은 색깔로…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 이명박 실험실에서 카렌 헤일 즈에서 전문가의 조언과 정자를 연구하는이 허용 방법을 설정하기위한 마이클 앤더슨에게 감사의 말씀을 전합니다. H.오다와 Y 아키야마 -오다 아낌없이 γ-튜 불린-GFP 재고 비행 제공. 이 작품은 LAL (GM074044)에 NIH R01 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish |
| PAP pen | Fisher Scientific | NC9888126 | Ted Pella #22309 |
| Clear nail protector | Wet n Wild | 7780235001 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-003 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 16% Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D-9542 | 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C |
| NaCl | Research Products International Corp. | S23020 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Kimwipes delicate task wipers | Fisher Scientific | S47299 | |
| BSA | Research Products International Corp. | A30075 | Molecular biology grade |
| Glass Coplin staining jar, screw cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 | |
| Single frosted microscope slides | Corning | 2948-75X25 | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Polysciences, Inc. | 22247-1 | Optional (to replace untreated microscope slides ) |
| Square cover glass | Corning | 2865-22 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Kimax Petri dish | Fisher Scientific | S31473 | Kimble #23060 10015 EMD |
| Forceps | Dumont | 52100-51S | Pattern 5 INOX |
| Name of Equipment | Company | ||
| Stemi 2000-CS stereoscope | Carl Zeiss | ||
| Eclipse 80i | Nikon | ||
| Plan-Fluor 40x objective | Nikon | ||
| Axiophot | Carl Zeiss | ||
| Plan-Neofluar Ph2 40x objective | Carl Zeiss |
Referências
- McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
- Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
- Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
- de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
- Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
- Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
- McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
- Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
- Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
- Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genética. 135, 489-505 (1993).
- Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
- Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genética. 167, 207-216 (2004).
- Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).
- Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
- Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genética. 153, 837-844 (1999).
- Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
- Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
- Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
- Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
- Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
- Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
- Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
- Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
- Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
- Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
- Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
- Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
- Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).
