相互作用するリガンドおよび/またはアンタゴニストと、哺乳動物核内受容体残基を同定するために逆酵母ツーハイブリッドシステム
Summary
ケトコナゾールに結合し、プレグナンX受容体（PXR）の活性化に拮抗する。 PXR変異体の酵母ハイスループットスクリーニングは、ケトコナゾールが結合するための独自の領域を規定する。この酵母ベースの遺伝的方法は、表面結合部位と会合したリガンドを有する新規な核内受容体相互作用を検出します。
Abstract
薬物代謝および炎症の重要な調節因子として、プレグナンX受容体（PXR）は、代謝、炎症（ 例えば脂肪肝） の1,2を結ぶ疾患の病態生理に重要な役割を果たしている。 PXRのアゴニストリガンドの同定に多くの進歩があったが、薬物様拮抗薬およびPXR 3,4,5上のそれらの結合部位の限られた記述があります。重大な障壁を効率的PXRは1998年にクローニングされ、特徴付けられたという事実にもかかわらず、拮抗薬との構造の研究のために、完全長のタンパク質を精製することができないことであった。当研究室では、PXR 6に結合残基、アンタゴニスト、ケトコナゾールのを定義するのに基づく新規のハイスループット酵母ツーハイブリッドアッセイを開発しました。我々の方法は、ケトコナゾールと対話することが期待PXRのAF-2表面上の単一変異の効果を救うだろ突然変異のライブラリを作成する必要があります。救助または「機能獲得型」セコndは突然変異はPXRにケトコナゾールの遺伝的相互作用および表面残基（複数可）に関する結論が実現可能であるようにすることができる。従って、我々はそのコアクチベーター、SRC-1との相互作用PXR変異体の高スループットツーハイブリッド酵母画面を開発しました。酵母は抗真菌薬、ケトコナゾールの研究に対応するように変更されたこのアプローチを、使用して、我々は、ケトコナゾールに結合することができないのクローンが濃縮されたPXRに特定の変異を実証できた。逆論理によって、我々は、元の残基はケトコナゾールとの直接的な相互作用残基であると結論付けている。このアッセイは、核内受容体表面上の結合部位アンタゴニストをスクリーニングするための新規な、扱いやすい遺伝的アッセイを表す。このアッセイは、酵母、ならびに標準的な構造生物又はプロテオミクスベースの方法を使用して研究することができない細胞タンパク質（単数または複数）に関係なく、その細胞傷害能の任意の薬物に適用することができる。潜在的な落とし穴は、データの解釈（相補メソッド便利）、信頼を含めるシングルY2H法、酵母を取り扱うまたは酵母ツーハイブリッドアッセイを実施する専門知識、およびアッセイの最適化にある低インピーダンス。
Introduction
酵母ツーハイブリッド（Y2H）アッセイが広くタンパク質-タンパク質相互作用を発見するために使用され、より最近では、タンパク質-タンパク質相互作用複合体7、図8、図9、図10、図11を破壊する新規な小分子の発見のために。しかし、このアッセイの従来のアプローチは、創薬または「ヒット」のために使用、改変された時にはまだ相互作用し、改変された残基11の尋問を可能にすること、タンパク質-タンパク質表面内の化学薬品化合物のアロステリック相互作用残基の検出を可能にしない。実際に、このような方法（単数または複数）は、開発することが可能であれば、タンパク質 – タンパク質相互作用の破壊のための重要なアロステリック相互作用残基のハイスループット評価に扱いやすい酵母系を可能にする。薬物発見の文脈において、タンパク質と化合物の相互作用を確立するための最も直接的な方法は、構造決定（タンパク質-阻害剤複合体、例えば crystalization）を含むであろう。これらのメソッドは中出しですbersome、精巧なリソースを使用し、それはすべてのタンパク質上の構造研究を行うことは技術的に実現不可能である。
扱いやすい遺伝的薬剤スクリーニング系は、細菌、1,2および哺乳動物ツーハイブリッドなどの他のモデル系において確立されている。しかしながら、これらのシステムは、Y2Hのような最適化および代替システムがまだほとんどの薬物発見で試験する必要がある。乏しい感度および特異法13を用いて相互作用の信頼性を含む限界があるが、単一のY2Hアッセイは、相互作用残基に関する特定の質問に答えるように改変することができる。核内受容体研究の分野において、Y2Hは、相互作用タンパク質14を定義するために使用されてきたが、これらのタンパク質相互作用はほとんど/アンタゴニストは、核受容体-タンパク質複合体と相互作用するリガンドた性質を定義するために使用されていない。したがって、我々の研究室では、特にありません受容体タンパク質のために、メソッドを定義することに力を注い逆Y2Hベースの検出プラットフォームを使用して残留物を相互作用新規リガンド/アンタゴニストを発掘だろ基づく方法を、プロテオミクスに容易に適用できる。
ケトコナゾールはPXRとその活性化因子SRC-1を破壊という我々の以前の知見に基づいて、我々は小説はPXR 6にケトコナゾール作用する残基を定義して、質問するために私達を可能にするY2H系を逆に開発しました。我々の方法は、DNA結合および転写活性化に関与する分離可能なドメインからなる酵母GAL4タンパク質の特性に基づく。タンパク質はGAL4活性化ドメインとの融合体として発現される完全長クチベーターSRC-1（ステロイド受容体コアクチベーター1）しながら、PXR LBDタンパク質はAD（LexAのDNA結合ドメイン（DNA-BD）との融合体として発現される）。 PXR及びSRC-1融合タンパク質間の相互作用は、酵母genomに統合されたレポーター遺伝子β-LacリZを含有するGAL4結合部位の転写活性化をもたらすE。ケトコナゾール、PXRアンタゴニストは、PXR及びSRC-1の相互作用15、16、17を破壊し、我々はX-gal活性のためのフィルター上のコロニーを染色した後、ケトコナゾールの存在下又は非存在下でPXR及びSRC-1との相互作用を検出することができる。 Y2Hの原理は、図1に示されており、実験手順を図2にまとめる。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちの修正Y2Hアッセイでは、PXR 6上のケトコナゾールとの相互作用に重要な残基を同定した。 SRC-1はコアクチベーターである（及びpGADNotベクターにクローニングした）ので、我々はまた、SRC-1は、これが活性化プロフィールを変更および/または漏出性に影響を与えるかどうかをPSHベクター系にクローン化されたときにlacZ発現を活性化し得るかどうかを試験した酵母ツーハイブ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、衛生研究所（NIH）の国立研究所によってサポートされていましたCA127231と（SM）のデイモンラニヨン財団臨床研究者賞（CI 1502）を付与します。我々は彼らの機関やプロトコルの標準化へのこの技術の移植性を議論に彼の有用な洞察のためパラツキー大学オロモウツ、チェコ共和国からの教授ズデニェクドヴォルザークに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Strain CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ | Our lab | CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genes6 . | |
| YPD Growth Medium | BD Biosciences | 630409 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate | BD Biosciences | 233520 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture | MP Biomedicals | 4250-412 | |
| ONPG (o-Nitrophenyl Β-D- Galactopyranoside). | Sigma-Aldrich | N1127 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Luria Broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| X-Gal | Fisher | BP-1615 | |
| Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml) | Life Technology | 156-017 | |
| Ampicillin | Acros Organics | 61177 | |
| Ketoconazole | Sigma-Aldrich | K1003 | |
| N,N-Dimethylformamide | Acros Organics | 326871000 | |
| Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| 50% PEG-3350 solution, filter-sterilized | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
| Nitrocellulose Membrane | Whatman | 10402091 | |
| 10 cm Petri Dish | Fisher | 875712 | |
| 5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3' | our lab | PXR LBD forward primer for pSH2-1 | |
| 5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3' | our lab | PXR LBD reverse primer for pSH2-1 | |
| 5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3' | our lab | SRC-1 forward primer for pGADNOT | |
| 5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3' | our lab | SRC-1 reverse primer for pGADNOT | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| BamHI | our lab | R0136 | |
| SalI | our lab | R0138 | |
| NotI | our lab | R0189 |
Referências
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