Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo

Resumo

O processo de cura de feridas envolve as células tráfico de proteínas específicas e os compartimentos intracelulares para o local da lesão da membrana celular. Este protocolo descreve os ensaios para monitorar esses processos.

Resumo

A capacidade das células para curar feridas é um processo celular fundamental, mas os mecanismos celulares e moleculares envolvidas na cura feridas células estão mal compreendidos. Aqui são descritos os ensaios para monitorar a capacidade e cinética de cura das células em cultura após a lesão localizada. O primeiro protocolo descreve uma abordagem ponto final baseado para avaliar simultaneamente reparo da membrana celular capacidade de centenas de células. O segundo protocolo descreve uma abordagem de imagem em tempo real para monitorar a cinética de reparo da membrana celular em células individuais, após lesão localizada com um laser pulsado. Como as células de cura feridas envolve o tráfico de proteínas específicas e os compartimentos intracelulares para o local da lesão, o terceiro protocolo descreve o uso de uma abordagem baseada ponto final acima para avaliar um tal evento tráfico (lisossomal exocitose) em centenas de células lesionadas e simultaneamente o último protocolo descreve o uso de lesões de laser pulsado em conjunto com micros TIRFcópia para monitorar a dinâmica de compartimentos subcelulares individuais em células lesadas em alta resolução espacial e temporal. Embora os protocolos aqui descrever a utilização dessas abordagens para estudar a relação entre a reparação da membrana celular e exocitose lisossomal em células musculares em cultura, podem ser aplicadas como tal, para qualquer outra célula de cultura aderente e compartimento subcelular de escolha.

Introdução

Membrana celular mantém a integridade das células, fornecendo uma barreira entre a célula e para o ambiente extracelular. Um estímulo químico, elétrico ou mecânico que exceder o limite fisiológico normal, assim como a presença de patógenos invasores cada um pode resultar em prejuízo para a membrana da célula e desencadear uma resposta celular subseqüente para reparar esse dano. Para sobreviver essas lesões na membrana celular, as células possuem um mecanismo eficiente para o reparo. Este mecanismo é dependente de cálcio e envolve o tráfico intracelular de proteínas, tais como anexinas e MG53, entre outros, bem como os compartimentos intracelulares tais como endossoma....

Protocolo

1. Repair Membrana imagens de células Usando Granel (grânulo de vidro) Wounding

Este protocolo permite a marcação separadamente as células feridos e aqueles que não conseguem curar. A quantificação destas populações de células requer a utilização de três condições: 1. Teste (C1) - As células são deixadas a reparar na presença de ^{Ca2 +,} 2. Controlo 1 (nenhuma lesão C2) - As células são incubadas na presença de Ca ^{2 +,} mas não lesionado, e 3. Controlo 2 (sem reparação C3) - células são deixadas para reparar na ausência de Ca ^{2 +.}

1. Cultivar células de> 50% de confluência em três lamelas estéreis e l....

Resultados

Protocolos aqui descritas para imagens de células único são monitorar a capacidade e cinética de reparo da membrana celular (protocolos 1 e 2) eo tráfico subcelular e fusão de lisossomos durante a reparação (Protocolos 3 e 4).

Protocolo 1 mostra um ensaio de massa que permite marcar todas as células lesionadas e identificar as células danificadas que não conseguiram reparar. Os resultados na Figura 1 mostram que, enquanto as células não lesionados (Figura 1 A)

Discussão

Lesão da membrana celular in vivo ocorre devido a uma variedade de factores de stress fisiológico e várias abordagens experimentais foram desenvolvidos para imitar estes. Estes incluem ferindo membrana celular das células aderentes raspando-los fora do prato ou por passagem através de um furo de ^9,10 seringa estreita. Depois de tais lesões das células curar em suspensão e não adere à matriz extracelular, como sucede normalmente em tecido. Ainda outros, como o uso de poros formando toxinas alterar qui.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
HBSS	Sigma	H1387	Usado para preparar CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)
HEPES	Fisher	BP410	Usado para preparar CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)
FITC dextran (fixável por lisina)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml em contas de vidro CIM ou PBS
	Sigma	G8772
TRITC dextrano (fixável por lisina)	Invitrogen	D1818	2 mg / ml em CIM ou PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% em PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 em
PBS FM corante	Invitrogen	T3163	1 µ g/µ l em CIM ou PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml em meio de crescimento
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in meio de crescimento
Alexa Fluor 488 anti-rato para galinhas IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in solução de bloqueio
Mídia de montagem	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Petridish com fundo de vidro	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Anel O de	siliconeBellco	1943-33315
Porta-lamínulas	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Usado para meio de crescimento: 10% FBS, 1% P/S em DMEM
Penicilina/Sreptomicina	VWR	12001-350	Usado para meio de crescimento: 10% FBS, 1% P/S em DMEM
Soro de galinha	Sigma	C5405	5% soro de galinha em CIM é usado para bloquear a solução durante a imunocoloração
PBS (livre de Ca2+ e Mg2+)	VWR	12001-664
Microscópio de epifluorescência	Olympus America, PA	IX81
Iluminador TIRF	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Iluminador de epifluorescência	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD	Camera Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Software de aquisição e análise de imagens	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Laser pulsado	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Incubadora de palco	Tokaihit, Japão	INUBG2ASFP-ZILCS