Imagerie de la membrane cellulaire des blessures et des processus sous-cellulaires impliquées dans la réparation
Summary
Le processus de guérison des cellules blessées implique trafic des protéines spécifiques et des compartiments subcellulaires au site de la lésion de la membrane cellulaire. Ce protocole décrit les essais de surveiller ces processus.
Abstract
La capacité des cellules blessés à guérir est un processus cellulaire fondamental, mais les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les cellules de guérison blessés sont mal compris. Voici les dosages sont décrits à surveiller la capacité et la cinétique de la guérison des cellules cultivées après une lésion localisée. Le premier protocole décrit une approche point final à base d'évaluer simultanément la capacité cellulaire de réparation de la membrane des centaines de cellules. Le deuxième protocole décrit une méthode de formation d'image en temps réel pour surveiller la cinétique de réparation de la membrane cellulaire dans des cellules individuelles après une lésion localisée avec un laser pulsé. Comme les cellules de guérison blessés implique trafic des protéines spécifiques et les compartiments sous-cellulaires au site de la blessure, le troisième protocole décrit l'utilisation de l'approche point final au-dessus de la base pour évaluer un tel événement de trafic (lysosomale exocytose) dans des centaines de cellules blessées simultanément et le dernier protocole décrit l'utilisation de blessure laser pulsé avec micros de la FRBRcopie de suivre la dynamique des compartiments cellulaires dans des cellules individuelles blessés à haute résolution spatiale et temporelle. Bien que les protocoles ci-dessous décrivent l'utilisation de ces approches pour étudier la relation entre la réparation des membranes cellulaires et lysosomale l'exocytose dans les cellules musculaires en culture, elles peuvent être appliquées en tant que telles pour toute autre cellule en culture adhérente et un compartiment subcellulaire de choix.
Introduction
Membrane cellulaire maintient l'intégrité des cellules en formant une barrière entre la cellule et le milieu extracellulaire. Un stimulus chimique, électrique, mécanique ou qui dépasse le seuil physiologique normal ainsi que la présence d'agents pathogènes envahissants peut chaque résultat des blessures à la membrane de la cellule et de déclencher une réponse cellulaire à la suite de la réparation de ce préjudice. Pour survivre ces blessures à la membrane cellulaire, les cellules possèdent un mécanisme efficace pour la réparation. Ce mécanisme est dépendante du calcium et implique le trafic intracellulaire des protéines telles que des annexines et MG53, entre autres, ainsi que des compartiments subcellulaires tels que des endosomes, les lysosomes, l'appareil de Golgi et des vésicules dérivées des mitochondries vers la membrane cellulaire lésé 1-7. Toutefois, les détails de la séquence d'événements moléculaires et sous-cellulaires impliqués dans la réparation de la membrane cellulaire endommagée reste mal comprise.
La réponse de réparation de la cellule peuvent être séparés dans l'oreillement et les réponses tardives. Les premières réponses, qui se produisent en quelques secondes à l'échelle minutes de temps, sont extrêmement important dans la détermination de la nature des réponses tardives menant à la réparation cellulaire succès ou la mort cellulaire. point final des analyses basées sur l'analyse biochimique et cellulaire vrac ont permis d'établir l'implication des processus moléculaires et cellulaires de réparation. Mais, en raison de l'hétérogénéité et de la rapidité de la réponse de la réparation cellulaire, point final des essais ne parviennent pas à fournir les détails cinétiques et spatiales de la séquence des événements menant à réparer. Les approches qui permettent blessure contrôlée de la membrane cellulaire et permettent le suivi de la réparation de la membrane cellulaire et subcellulaire des réponses associées à une résolution spatiale et temporelle sont idéales pour de telles études. Ici, ces approches ont été présentées. Deux des protocoles décrivent des approches pour contrôler les cinétiques réelles de temps de la réparation des membranes cellulaires et sous-cellulaires des réponses associées au processus de réparation dans les cellules vivantes suivants inj laserUry. En complément de ces analyses basées imagerie des cellules vivantes, le point de fin des essais ont également été décrits qui fournissent une mesure basée sur la population pour la réparation de suivi de cellules individuelles et les réponses des sous-cellulaires associées. Pour démontrer l'utilité de ces approches ont été utilisées pour surveiller le trafic et l'exocytose de lysosomes en réponse à une lésion de la membrane cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
lésion de la membrane cellulaire in vivo se produit en raison d'une variété de facteurs de stress physiologiques et plusieurs approches expérimentales ont été mises au point pour imiter ceux-ci. Il s'agit notamment de blesser la membrane cellulaire des cellules adhérentes en les grattant le plat ou par passage à travers un étroit 9,10 alésage de la seringue. A la suite de telles blessures guérissent les cellules en suspension et pas adhéré à la matrice extracellulaire comme ils …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé Subventions AR055686 et AR060836 et bourse de recherche postdoctorale à l'AD par l'Association française contre les myopathies (AFM). Le centre d'imagerie cellulaire utilisé dans cette étude est soutenue par les Instituts nationaux de la santé Subventions HD040677.
Materials
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
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