एक orthotopic Glioblastoma माउस मॉडल मस्तिष्क parenchymal शारीरिक बाधाओं को बनाए रखने और intravital दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त
Summary
हम ट्यूमर के विकास के दौरान खेलने पर सामान्य रूप से biophysical बाधाओं का स्मरण दिलाता है कि intravital दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए चूहों में एक cortical orthotopic glioblastoma मॉडल की स्थापना की है. ट्यूमर से ऊपर खोपड़ी की जगह एक पुरानी खिड़की के कांच दो photon माइक्रोस्कोपी द्वारा समय पर ट्यूमर प्रगति की अनुवर्ती सक्षम बनाता है.
Abstract
Glioblastoma मल्टीफार्मी (जीबीएम) तिथि करने के लिए उपलब्ध नहीं उपचारात्मक उपचार के साथ मस्तिष्क ट्यूमर के सबसे आक्रामक रूप है.
इस विकृति की murine मॉडल ड्यूरा-मेटर का चीरा निम्नलिखित मस्तिष्क पैरेन्काइमा में glioma कोशिकाओं का एक निलंबन के इंजेक्शन पर भरोसा करते हैं. कोशिकाओं intravital दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए सुलभ हो अल्पज्ञता इंजेक्शन जा करने के लिए है, जबकि सतही इंजेक्शन physiopathological शर्तों पुनरावृत्ति करने में विफल. दरअसल, इंजेक्शन तंत्र के माध्यम से बचने के सबसे ट्यूमर कोशिकाओं वे पैरेन्काइमा से यांत्रिक कमी के अभाव में असामान्य रूप से तेजी से विस्तार जहां अतिरिक्त dural अंतरिक्ष तक पहुँचने.
हमारे सुधार focally एक glioma अंडाकार आकृति दाखिल बजाय सेरेब्रल कॉर्टेक्स की ऊपरी परत में glioma कोशिकाओं का एक निलंबन इंजेक्शन लगाने में बल्कि surroun से चिपके है कि एक पार से जुड़े dextran जेल Hemi-मनका द्वारा इंजेक्शन साइट clogging में न केवल मिलकरडिंग पैरेन्काइमा और cyanoacrylate साथ ड्यूरा-मेटर को सील कर दिया. कुल मिलाकर इन उपायों मस्तिष्क पैरेन्काइमा अंदर ट्यूमर कोशिकाओं के शारीरिक विस्तार और घुसपैठ को लागू. एक कांच की खिड़की निशान ऊतक विकास के अभाव में सप्ताह से अधिक पुरानी इमेजिंग अनुमति देने के लिए खोपड़ी के लिए पुख्ता साथ कपाल – उच्छेदन अंत में बंद कर दिया था.
हम glioma कोशिकाओं, न्यूरॉन्स (जैसे Thy1-इंडोनेशियाई चूहों) और वाहिका संरचना (एक फ्लोरोसेंट डाई की एक अंतःशिरा इंजेक्शन से प्रकाश डाला) के बीच होने वाली बातचीत की गतिशीलता intravital से देखे जा सकते हैं पता चला है कि फ्लोरोसेंट ट्यूमर कोशिकाओं के साथ grafted फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक जानवरों का लाभ उठाते हुए रोग की प्रगति के दौरान दो photon माइक्रोस्कोपी.
एक न्यूनतम के साथ छेड़छाड़ मस्तिष्क वातावरण में सूक्ष्म प्रस्ताव पर छवि एक ट्यूमर को संभावना न्यूरो ऑन्कोलॉजी और नशीली दवाओं के परीक्षण के क्षेत्र को लाभ होना चाहिए, जो वर्तमान जीबीएम पशु मॉडल की एक सुधार का प्रतिनिधित्व करता है. </p>
Introduction
Glioblastoma मल्टीफार्मी 12 महीने की एक औसत अस्तित्व के साथ वयस्कों में मस्तिष्क ट्यूमर के सबसे आक्रामक रूप और 5% से 5 साल के जीवित रहने की दर के रूप में प्रकट होता है. नैदानिक प्रबंधन सर्जरी, रेडियोथेरेपी और अक्सर संयोजन में उपयोग रसायन चिकित्सा पर निर्भर करता है. हालांकि, इन उपचार के प्रभाव को 1-3 उपशामक रहते हैं.
अब तक, न्यूरो ऑन्कोलॉजी अध्ययन के अधिकांश (उदाहरण 4,5 के लिए देखें) केवल एक स्थिर दृष्टिकोण प्रदान करने में सक्षम हैं और ट्यूमर असर पशुओं की बड़ी साथियों पर प्रदर्शन अलग समय बिंदुओं पर बलिदान किया है कि तकनीक पर भरोसा करते हैं. intravital इमेजिंग के आधार पर अनुवर्ती तरीकों की हाल ही में विकास glioma विकास और ट्यूमर कोशिकाओं और समय के साथ ही पशु पर उनके pathophysiological microenvironment के बीच बातचीत का अध्ययन कर देता है. यह 6 अब तक पहुंच से बाहर था कि जानकारी के अनन्य टुकड़ा करने के लिए रास्ता खुल जाता है. ब्याज की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट टैग व्यक्त ट्रांसजेनिक जानवर उपयोग किया जा सकता हैइस पत्र में ट्यूमर कोशिकाओं और जैसे न्यूरॉन्स के बीच विशिष्ट बातचीत का अध्ययन करने के लिए डी.
पिछले दशक के दौरान, intravital दो photon माइक्रोस्कोपी 7 के साथ (> 500 ड्यूरा-मेटर नीचे माइक्रोन) मौलिक न्यूरो ऑन्कोलॉजी अध्ययन और preclinical परीक्षण माउस मस्तिष्क के गहरे intravital अवलोकन प्रदर्शन करने की क्षमता के लिए 8,9 में एक स्वर्ण मानक बन गया है एक micrometric स्थानिक संकल्प 10. एक पुरानी कपाल खिड़की 11 के साथ प्रत्यारोपित orthotopical पशु मॉडलों के साथ intravital दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग, यह एक ही माउस 9,12 पर समय के साथ ट्यूमर प्रगति का पालन करने के लिए संभव है.
ये पहले से प्रकाशित पशु मॉडल की प्रमुख कमियां की है कि वे ड्यूरा-मेटर सेल निलंबन 9,13,14 के इंजेक्शन के बाद सील नहीं है के रूप में ट्यूमर के विकास को नियंत्रित करने वाले शारीरिक बाधाओं की नकल नहीं है कि हालांकि है. Glioma कोशिकाओं में रिसाव हो सकता हैएक heterotopic एक में एक orthotopic glioma मॉडल बदलने extradural अंतरिक्ष.
यहाँ प्रस्तुत पशु मॉडल एक पार से जुड़े dextran जेल Hemi-मनका और histo संगत गोंद के साथ ड्यूरा-मेटर की सील द्वारा पीछा 200 माइक्रोन की गहराई में सेरेब्रल कॉर्टेक्स में फ्लोरोसेंट glioma कोशिकाओं का एक अंडाकार आकृति के इंजेक्शन में होते हैं . ट्यूमर के विकास को फिर pathophysiological शारीरिक बाधाओं का कहना है कि मस्तिष्क पैरेन्काइमा के लिए प्रतिबंधित है. ट्यूमर से ऊपर प्रत्यारोपित एक पुरानी कांच की खिड़की intravital दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए एक आसान उपयोग ऑप्टिकल अनुमति देता है. यह समय के साथ glioma विकास की एक अनुवर्ती करने के लिए और (फ्लोरोसेंट dextrans के साथ प्रकाश डाला न्यूरॉन्स और वाहिका संरचना के साथ यहाँ) अपने microenvironment के साथ अपनी बातचीत का अध्ययन करने के लिए संभव है ब्याज की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट टैग व्यक्त ट्रांसजेनिक जानवर का उपयोग करना.
Protocol
Representative Results
Discussion
यह दृष्टिकोण ऑप्टिकल इमेजिंग तरीकों का उपयोग दिनों और हफ्तों के एक orthotopically प्रत्यारोपित glioma के विकास पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है. वही पशु बाद में विकृति के दौरान लगभग किसी भी मस्तिष्क इमेजिंग साधन क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों गरमी डा. केके Fenrich, डा. एमसी धन्यवाद. Amoureux, पी. वेबर और उपयोगी विचार विमर्श के लिए ए Jaouen; एम. Hocine, सी. Meunier, एम. Metwaly, एस Bensemmane, जे Bonnardel, IBDML में जानवरों की सुविधा और तकनीकी समर्थन के लिए IBDML पर PicSIL इमेजिंग मंच के कर्मचारियों का स्टाफ. इस काम जीआर, एजेंस Nationale डे ला Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), फेडरेशन के राष्ट्रीय Institut डु कैंसर (Inca-DGOS-INSERM6038) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था महासंघ से फैलोशिप द्वारा, एफडी को ला Recherche सुर ले Cerveau (एफआरसी) डालना सीआर के लिए डी ला Recherche médicale और Cancéropole PACA.
Materials
| Drill | Dremel (Germany) | 398 | any high quality surgical bone drill would suffice |
| Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | also sold by Harvard Apparatus |
| Tissue scissors | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Dumont tweezers M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Dental cement | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (France) | Cyanolit 201 | |
| Glass capillaries without filament | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Microliter syringe (25 µl) | Hamilton (USA) | 702 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments (USA) | Kite-R | |
| T derivation (3-way stopcock – Luer lock) | World Precision Instruments (USA) | 14035-10 | |
| Stereotactic frame (mouse adaptor) | World Precision Instruments (USA) | 502063 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments (USA) | CS-5R (64-0700) | |
| Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads | Available from various suppliers including Sigma (Germany) | ||
| Eye ointment | TVM (France) | Ocry-gel | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII (Germany) | also sold by other companies | |
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP (Germany) | also sold by other companies (Nikon, …) | |
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | also sold by other companies |
Referências
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