Un modèle de souris orthotopique glioblastome maintien contraintes physiques et parenchyme cérébral Convient pour intravitale deux microscopie biphotonique
Summary
Nous avons établi un modèle de glioblastome orthotopique corticale chez la souris pour intravitale microscopie à deux photons qui récapitule les contraintes biophysiques normalement en jeu au cours de la croissance de la tumeur. Une fenêtre en verre chronique remplaçant le crâne au-dessus de la tumeur permet le suivi de la progression de la tumeur au cours du temps par microscopie à deux photons.
Abstract
Le glioblastome multiforme (GBM) est la forme la plus agressive des tumeurs cérébrales avec aucun des traitements curatifs disponibles à ce jour.
Les modèles murins de cette pathologie reposent sur l'injection d'une suspension de cellules de gliome dans le parenchyme du cerveau suite à une incision de la dure-mère. Alors que les cellules doivent être injectés superficiellement pour être accessible à intravitale microscopie à deux photons, injections superficielles ne parviennent pas à récapituler les conditions physiopathologiques. En effet, s'échappant par le tube d'injection plupart des cellules tumorales parviennent de l'espace extra-dural où ils se détendent anormalement rapide en l'absence de contraintes mécaniques du parenchyme.
Nos améliorations consistent non seulement dans l'implantation focalement un sphéroïde de gliome, plutôt que l'injection d'une suspension de cellules de gliome dans les couches superficielles du cortex cérébral, mais aussi dans le colmatage du site d'injection par un dextrane gel hémi-bourrelet réticulé qui est collée à la surrounding parenchyme et scellé dure-mère avec cyanoacrylate. Au total, ces mesures imposent l'expansion physiologique et l'infiltration des cellules tumorales à l'intérieur du parenchyme cérébral. Craniotomie a été finalement fermé par une fenêtre en verre collée sur le crâne pour permettre l'imagerie chronique pendant des semaines en l'absence de développement de tissu cicatriciel.
Profitant d'animaux transgéniques fluorescentes greffées avec des cellules tumorales fluorescentes, nous avons montré que la dynamique des interactions qui se produisent entre les cellules de gliome, les neurones (par exemple souris Thy1-PCP) et vasculaire (mis en évidence par une injection intraveineuse d'un colorant fluorescent) peuvent être visualisés par intravitale microscopie à deux photons au cours de la progression de la maladie.
La possibilité à l'image d'une tumeur à la résolution microscopique dans un environnement cérébrale peu compromis représente une amélioration de modèles animaux GBM actuelles qui devraient bénéficier le domaine de la neuro-oncologie et de dépistage des drogues. </p>
Introduction
Le glioblastome multiforme apparaît comme la forme la plus agressive de tumeur cérébrale chez les adultes avec une survie médiane de 12 mois et un taux de survie à 5 ans de 5%. Gestion clinique repose sur la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie souvent utilisé en combinaison. Cependant, les effets de ces traitements restent palliatifs 1-3.
Jusqu'à présent, la plupart des études de neuro-oncologie reposent sur des techniques qui ne sont en mesure de fournir une vision statique et exécutées sur de grandes cohortes de tumeurs des animaux portant sacrifiés à différents points dans le temps (voir par exemple 4,5). Le développement récent de méthodes de suivi basé sur l'imagerie intravitale permet d'étudier la croissance des gliomes et les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement physiopathologique sur le même animal au fil du temps. Cela ouvre la voie à pièce exclusive de l'information qui était jusqu'ici irréalisable 6. Les animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents dans les cellules d'intérêt peuvent être utiliséd pour étudier les interactions spécifiques entre les cellules tumorales et par exemple les neurones dans le présent document.
Au cours de la dernière décennie, intravitale microscopie à deux photons 7 est devenu un standard de l'or dans les études de neuro-oncologie fondamentales et des essais précliniques 8,9 pour sa capacité à effectuer observation intravitale profonde de cerveau de souris (> 500 um en dessous de la dure-mère) avec une résolution spatiale micrométrique 10. Utilisation intravitale microscopie à deux photons avec des modèles animaux orthotopique implantés avec une fenêtre crânienne 11 chronique, il est possible de suivre la progression de la tumeur au cours du temps sur le même 9,12 de la souris.
L'un des inconvénients majeurs de ces modèles animaux précédemment publiés est cependant qu'ils n'imitent pas les contraintes physiques qui régissent l'évolution de la tumeur comme la dure-mère n'est pas scellé après l'injection de la suspension de cellules 9,13,14. cellules de gliome peuvent fuir dans leespace extradural transformer un modèle de gliome orthotopique en un hétérotopique.
Le modèle animal présenté ici consiste dans l'injection d'un sphéroïde de cellules de gliome fluorescents dans le cortex cérébral, à une profondeur de 200 pm, suivie par la fermeture de la dure-mère avec un dextrane gel hémi-bourrelet réticulé et de la colle d'histo-compatible . La croissance de la tumeur est alors limité au parenchyme cérébral qui maintient contraintes physiques physiopathologiques. Une fenêtre de verre chronique implanté au-dessus de la tumeur permet un accès facile pour optique intravitale microscopie à deux photons. L'utilisation d'animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents dans les cellules d'intérêt, il est possible d'effectuer un suivi de la croissance des gliomes au fil du temps et à étudier son interaction avec son micro-environnement (ici avec les neurones et le système vasculaire en surbrillance avec des dextranes fluorescents).
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette approche permet l'utilisation de méthodes d'imagerie optique pour surveiller au fil des jours et des semaines, la croissance d'un gliome orthotopique implanté. Le même animal peut ensuite être soumis à pratiquement n'importe quelle modalité d'imagerie cérébrale au cours de la pathologie; encore la préparation spécifique microscopie à deux photons offre l'occasion unique de parvenir à la résolution subcellulaire dans le cerveau de l'animal vivant. Notre protocole présente l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient chaleureusement le Dr KK Fenrich, le Dr MC. Amoureux, P. Weber et A. Jaouen pour des discussions utiles; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, le personnel de l'animalerie à IBDML et le personnel de la plate-forme d'imagerie PicSIL à IBDM pour le support technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut national du cancer du (INCA-DGOS-INSERM6038) à GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) à FD, par des bourses de la Fédération de la Recherche Médicale et Cancéropôle PACA CR.
Materials
| Drill | Dremel (Germany) | 398 | any high quality surgical bone drill would suffice |
| Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | also sold by Harvard Apparatus |
| Tissue scissors | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Dumont tweezers M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Dental cement | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (France) | Cyanolit 201 | |
| Glass capillaries without filament | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Microliter syringe (25 µl) | Hamilton (USA) | 702 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments (USA) | Kite-R | |
| T derivation (3-way stopcock – Luer lock) | World Precision Instruments (USA) | 14035-10 | |
| Stereotactic frame (mouse adaptor) | World Precision Instruments (USA) | 502063 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments (USA) | CS-5R (64-0700) | |
| Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads | Available from various suppliers including Sigma (Germany) | ||
| Eye ointment | TVM (France) | Ocry-gel | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII (Germany) | also sold by other companies | |
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP (Germany) | also sold by other companies (Nikon, …) | |
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | also sold by other companies |
Referências
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