En orthotopic Glioblastoma Mouse Model Opprettholde Brain Parenkymalt fysiske begrensninger og Egnet for Intravital To-foton mikroskopi
Summary
Vi har etablert en cortical orthotopic glioblastoma modell i mus for intra to-foton mikroskopi som sammenfatter de biofysiske begrensninger normalt være i sving under veksten av svulsten. En kronisk glass vindu erstatte skallen ovenfor svulsten gjør at oppfølgingen av svulsten progresjon over tid ved to-foton mikroskopi.
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) er den mest aggressive formen for hjernesvulster uten kurative behandlinger tilgjengelig til dags dato.
Murine modeller av denne patologi er avhengige av injeksjon av en suspensjon av glioma celler i hjernen parenchyma følgende innsnitt av dura-mater. Mens cellene må injiseres overfladisk å være tilgjengelig for intra to-foton mikroskopi, overfladiske injeksjoner klarer å rekapitulere de physiopathological forhold. Faktisk, rømmer gjennom injeksjonskanalen de fleste kreftceller nå ekstra-dural plass hvor de utvider unormalt raskt i fravær av mekaniske begrensninger fra parenchyma.
Våre forbedringer består ikke bare i focally implantering av en glioma sfæroide stedet for å injisere en suspensjon av glioma-celler i de overflatiske lag av hjernebarken, men også tetter injeksjonsstedet av en tverrbundet dextran-gel hemi-vulsten som er limt til omgivelding parenchyma og forseglet til dura-mater med cyanoacrylate. Til sammen viser disse tiltakene håndheve den fysiologiske utvidelse og infiltrasjon av kreftceller i hjernen parenchyma. Kraniotomi ble endelig avsluttet med et glass vindu sementert til skallen for å gi kroniske bildebehandling over uker i fravær av arrvev utvikling.
Benytte seg av fluorescerende transgene dyr podet med fluorescerende tumorceller vi har vist at dynamikken i samspillet som oppstår mellom gliomceller, nevroner (f.eks Thy1-CFP mus) og blodkar (markert med en intravenøs injeksjon av et fluorescerende fargestoff) kan visualiseres ved intra to-fotonmikroskopi under utviklingen av sykdommen.
Muligheten til bildet en svulst på mikroskopisk oppløsning i en minimal kompromittert cerebral miljøet representerer en forbedring av dagens GBM dyremodeller som skal nyte godt innen nevro-onkologi og narkotika testing. </p>
Introduction
Glioblastoma multiforme fremstår som den mest aggressive formen for hjernesvulst hos voksne med en median overlevelse på 12 måneder og en 5-års overlevelse på 5%. Klinisk styring er avhengig av kirurgi, radioterapi og kjemoterapi ofte brukt i kombinasjon. Men effekten av disse behandlingene er fortsatt palliativ 1-3.
Inntil nå, de fleste av nevro-onkologi studier er avhengige av teknikker som er bare i stand til å gi et statisk syn og utført på store årskull av tumorbærende dyr ofret på ulike tidspunkter (se for eksempel 4,5). Den siste utviklingen av metoder for oppfølging, basert på intra bildebehandling kan studere glioma vekst og samspillet mellom kreftceller og deres patofysiologiske mikromiljøet på samme dyr over tid. Dette åpner veien til eksklusive stykke informasjon som var så langt uoppnåelig seks. Transgene dyr uttrykker fluorescerende tagger i celler av interesse kan være brukd å studere spesifikke interaksjoner mellom kreftceller og f.eks nevroner i dette papiret.
I løpet av det siste tiåret, har intra to-foton mikros 7 blitt en gullstandard i fundamentale nevro-onkologi studier og prekliniske studier 8,9 for sin evne til å utføre dype intra observasjon av mus hjernen (> 500 mikrometer under dura-mater) med en micrometric romlig oppløsning 10. Ved hjelp av intravital to-fotonmikroskopi med orthotopical dyremodeller implantert med en kronisk kranie vindu 11, er det mulig å følge den tumorprogresjon over tid på den samme musen 9,12.
En av de største ulempene med disse tidligere publiserte dyremodeller er imidlertid at de ikke etterligner de fysiske begrensninger som styrer tumorvekst som dura mater-ikke er forseglet etter injeksjon av cellesuspensjonen 9,13,14. Glioma celler kan lekke iextradural plass transformere en orthotopic glioma modell i en heterotop ett.
Denne dyremodell er presentert her består i injisering av et sfæroide av fluorescerende glioma celler i cerebral cortex i en dybde på 200 mikrometer, etterfulgt av forsegling av dura-mater med en tverrbundet dextran-gel hemi-vulsten og histo-kompatibel lim . Tumorvekst blir deretter begrenset til hjernen parenchyma som opprettholder patofysiologiske fysiske begrensninger. En kronisk glass vindu implantert ovenfor svulsten gir en enkel optisk tilgang til intra to-foton mikroskopi. Ved hjelp av transgene dyr uttrykker fluorescerende tagger i celler av interesse det er mulig å utføre en oppfølging av glioma vekst over tid og å studere dens interaksjon med sitt mikromiljø (her med nerveceller og blodårer markerte med fluorescerende dekstraner).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne tilnærmingen tillater bruk av optiske avbildningsmetoder for å overvåke over dager og uker veksten av en orthotopically implantert glioma. De samme dyr kan deretter bli utsatt for praktisk talt alle hjerneavbildnings modalitet i løpet av den patologi; men de to-fotonmikroskopi bestemt preparat gir en unik mulighet til å oppnå subcellulære oppløsning inne i hjernen av det levende dyr. Vår protokoll presenterer den fordel å håndheve tumorvekst i den cerebrale parenkym fremfor ekstra-durally slik det skjer…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne hjertelig takk Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. Weber og A. Jaouen for nyttige diskusjoner; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, de ansatte på Dyreavdelingen ved IBDML og de ansatte på PicSIL bildebehandling plattformen på IBDML for teknisk support. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) til GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) til FD, ved stipend fra Fédération de la Recherche MEDICALE og Cancéropole PACA til CR.
Materials
| Drill | Dremel (Germany) | 398 | any high quality surgical bone drill would suffice |
| Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | also sold by Harvard Apparatus |
| Tissue scissors | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Dumont tweezers M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Dental cement | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (France) | Cyanolit 201 | |
| Glass capillaries without filament | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Microliter syringe (25 µl) | Hamilton (USA) | 702 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments (USA) | Kite-R | |
| T derivation (3-way stopcock – Luer lock) | World Precision Instruments (USA) | 14035-10 | |
| Stereotactic frame (mouse adaptor) | World Precision Instruments (USA) | 502063 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments (USA) | CS-5R (64-0700) | |
| Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads | Available from various suppliers including Sigma (Germany) | ||
| Eye ointment | TVM (France) | Ocry-gel | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII (Germany) | also sold by other companies | |
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP (Germany) | also sold by other companies (Nikon, …) | |
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | also sold by other companies |
Referências
- DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
- Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
- Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
- Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
- Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
- Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
- von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
- Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
- Newcomb, E., Zagzag, D., Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , 227-241 (2009).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
