Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em> C. elegans</em> Embriyo
Summary
Bu protokol, görüntüye Caenorhabditis elegans embriyolarında bir doku içinde bölünen hücreleri açıklamaktadır. Birkaç protokoller embriyonun erken görüntü hücre bölünmesi için, bu protokol nasıl mid geç embriyonik dönemde gelişmekte olan bir doku içinde hücre bölünmesi görüntü açıklar nasıl tarif ederken.
Abstract
Bu protokol, Caenorhabditis elegans, gelişmekte olan embriyo bölünen hücreleri görüntüye floresan mikroskobu kullanımını tarif eder. Özellikle, bu protokol epidermal hücrelerin altında bulunan ve epidermal morfogenezisi önemli olabilir neuroblasts, bölünmesi nasıl görüntü üzerinde duruluyor. Doku oluşumu metazoan gelişimi için çok önemlidir ve komşu dokuların dış işaretlere dayanmaktadır. C. elegans mikroskobu ile çalışmak için kendi dokuları kolay hale nedeniyle şeffaflık ve basit organizasyon in vivo doku morfogenetiğine incelemek için mükemmel bir model organizmadır. Ventral muhafaza embriyonun ventral yüzey epitel hücrelerinin tek bir tabaka ile kaplanmıştır süreçtir. Bu olay örten epitel hücrelerinin göçüne aracılık kimyasal rehberlik ipuçları sağlamak temel neuroblasts, kolaylaştırılabilir düşünülmektedir. Bununla birlikte, son derece nöro-proliferatif ve aynı zamanda hareket edebilirventral epidermal hücreler için mekanik bir alt-tabaka olarak. Bu deney protokolü kullanılarak yapılan çalışmalar, doku oluşumu sırasında arası iletişimin önemini ortaya çıkarmak olabilir, ve gelişmekte olan dokular içinde hücre bölünmesi ile ilgili genlerin rollerini ortaya çıkarmak için kullanılabilir.
Introduction
Nasıl görüntü hücre bölünmesi için erken C. anlatan protokoller var olsa elegans embriyo, bu protokol nasıl görüntü hücre bölünmesi orta Embriyogenez sırasında bir doku içinde açıklanır. Gelişimi sırasında organizmaların görüntülenmesinde önemli zorluklardan biri fototoksisite onların duyarlılık olmuştur. Ancak, dönen bir disk konfokal mikroskoplar veya süpürüldü alan mikroskoplar artan erişilebilirlik daha yaygın görüntüleme uygulamaları izin verdi. Her iki sistem de organizmalar maruz kaldığı UV sınırlandırarak, katı hal lazerleri ve dağınık ışık kullanır. Ancak, Widefield standları hala yüksek duyarlılık (örn. EMCCD), diyafram denetimi ve ışık kontrolü (örneğin, LED'ler veya ayarlanabilir cıva ampul) ile kameralar ile donatılmış olan, özellikle in vivo görüntüleme için kullanılabilir. Bu protokol, C, gelişmekte olan görüntü hücre bölünmesi için bir konfokal tabanlı bir sistem veya bir widefield sistemi ya nasıl kullanılacağını açıklar elegans </ Em> embriyolar. Örnek olarak, biz nasıl resim neuroblast hücre bölünmesini açıklayınız. Nöro-blastlar örten epidermal hücrelere, kimyasal ya da mekanik ipuçları sağlayarak epidermal morfolojilerinden kolaylaştırmak ve dokuların oluşumunda arası iletişimin önemi mükemmel bir örnek sağlayabilir.
Caenorhabditis elegans şeffaflığıyla ve basit doku organizasyonu 1 nedeniyle mikroskopi tabanlı çalışmalar için ideal bir model organizmadır. Ayrıca, C. elegans genetik yöntemler ve RNAi için uygun olan, ve genlerin çoğu insan homologlarını beri, bu doku oluşumu için 2-5 korunmuş mekanizmalarını tanımlamak için kullanılabilir. C. In Embriyo> 300 hücreleri olduğunda elegans, epidermis oluşumu, orta embriyojenez sırasında oluşur. Epidermal morfogenez embriyo büzülür epidermal hücrelerin bir tabaka içine ve embr dönüştürmek için uzanan bir süre boyunca birkaç büyük aşamadan oluşurBir solucan 6'nın uzun oval bir şekil formundan yo. Ventral epidermal hücreler embriyonun ventral yüzeyi (Şekil 1) kapsayacak şekilde ventral orta hat doğru geçiş yaparken, ventral muhafaza, bu morfogenetik olaylardan birini açıklamaktadır. İlk olarak, anterior bulunan öncü hücrelerin iki çift kontralateral komşularıyla 6 ile ventral onlar uygun orta hat ve sigorta doğru göç. Bu, ventral cep 6-7 oluşturma şekiller gibi kama oluşturan merkezi bir arka cep hücrelerinin taşınması takip eder. Cebi kapatır mekanizması iyi anlaşılmamıştır. Bir olasılık, bir supracellular aktin miyozin kasılma yapısı 8 yara iyileştirici benzer, moda gibi bir çanta dize birlikte cep hücreleri bağlar olduğunu. İlginç bir şekilde, cep hücrelerin bazı göç epidermi altında bulunan temel neuroblasts 9 (nöronal ön-maddeleri arasında, belirli alt-aracılık eders, Şekil 1 B).
Önceki çalışmalar nöro. VAB-1 (efrin reseptörü) ve VAB-2 (efrin ligand) yüksek neuroblasts olarak ifade edilmiştir ve birbirinden anterior ve posterior neuroblasts sıralama kolaylaştırmak edilir ventral epidermal hücre göçü ve ventral muhafaza düzenleyen gösterdi, ve VAB-1 veya VAB-2 neden ventral muhafaza mutasyonlar 10-13 fenotip. Bununla birlikte, promotör kurtarma deneyler VAB-1, aynı zamanda neuroblasts salgıladığı diğer rehberlik ipuçlarının için üstte ventral epidermal hücreleri ve reseptör olarak gerekli olduğunu göstermiştir ventral epidermal hücrelerinde 9 olarak ifade edilmiştir. Bu reseptörlerin herhangi mutasyonlar ventral muhafaza fenotiplerini neden olsa da kusurları nedeniyle neuroblast konumlandırma veya bağlı rehberlik yanıt ventral epidermal hücrelerin başarısızlık 14 istekalar Sorunlara ortaya çıkması durumunda, bu açık değildir. Nöroblastlar wi bölümü değiştirilmesirehberlik ipuçları salgılama yeteneğini etkileyen thout neuroblasts rolü ve epidermal morfolojilerinden sırasında mekanik girdi sağlama yeteneği ışık tutabilir. Son zamanlarda, bir hücre bölünmesi geni, ani-1 (anillin) yüksek neuroblasts (Şekil 2A) olarak ifade edilmiştir ve tükenme neuroblast bölme kusurlarına neden olduğu bulunmuştur. İlginçtir, bu embriyolar ventral muhafaza fenotipleri (Fotopoulos, Wernike ve Piekny, yayınlanmamış gözlemler) gösterilecek.
Anillin hücre bölünmesi için gerekli olan ve özellikle de, bir ana hücre fiziksel olarak iki yavru hücrelere bölündüğü işlemi tarif sitokinez, içindir. Sitokinler sıkıca düzgün kardeş kromatid ayrılması ile birlikte olduğundan emin olmak için mekan ve zaman olarak kontrol edilmesi gereken bir aktomizin kontraktil halka oluşumu ile tahrik edilir. Metazoan sitokinez ana düzenleyicisi RhoA (C. elegans RHO-1), bir küçük bir GTPaz olduğunuonun GTP-bağlı formda yönerge. GEF Ect2/ECT-2 RhoA-GTP kontraktil halka oluşturur ve girişini 15 aracılık eden alt baş efektörlerinin ile etkileşime sonra, RhoA etkinleştirir. Anillin C-terminalinde ile ve N-terminal ile aktin ve miyozin için RhoA bağlanan bir çok alan bir proteindir. Anillin memeli veya Drosophila S2 hücreleri 16 kontraktil halkanın konumunu stabilize etmek için gereklidir. Anillin tükenmesi yanal salınımlar geçmesi kasılma yüzük olur, ve sitokinez sonunda çok çekirdekli hücreler 17-19 oluşturulması başarısız. İlginç bir şekilde, her ne kadar C. elegans ani-1 it sitokinez için gerekli değildir, erken embriyo aktomizin kasılmasını koordine eder. Yukarıda açıklandığı gibi Ancak, ani-1 orta Embriyogenesis (Fotopoulos, Wernike ve Piekny, yayınlanmamış gözlemler) sırasında neuroblast sitokinez için gereklidir. Sitokinez başarısızlık neuroblasts sayısını ve konumunu değiştirecek ve loc etkileyebilecekKimyasal rehberlik ipuçlarının tirme ya da doku mekanik özelliklerini değiştirebilir. Her iki model de ventral muhafaza için neuroblasts otonom olmayan rolünü, ve embriyonik gelişim sırasında doku doku iletişimin önemini vurgulamak.
Bu deneysel protokol anlatıyor görüntü hücre bölünmesi sırasında C. elegans floresan mikroskopi kullanılarak orta embriyogenezis. Hücre bölünmesi mekanizmalar üzerinde çalışmaya Deneylerin çoğu hücre sınırlı sayıda (örneğin C. tek hücreli embriyo, Xenopus veya echinoderm elegans ile kültür tabaklarında (örn.. HeLa veya S2 hücreleri) tek hücre ya da erken embriyolar gerçekleştirilmiştir embriyo). Ancak, bu bölünme uçağın zamanlaması ve yerleştirme etkileyebilecek dış ipuçları olduğu gibi, aynı zamanda dokuların içinde hücre bölünmesi çalışma için önemlidir. Ayrıca, hücreler komşu doku gelişimini etkilemek için kimyasal veya mekanik ipuçları verebilirs, ve hücreler arası iletişim gelişimi sırasında meydana dokuların nasıl yardımcı anlamak önemlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, orta embriyojenez sırasında görüntü hücre bölünmesi için mikroskopla çeşitli kullanımını tarif eder. Özellikle, bu protokol nasıl epidermal morfogenetiğine kolaylaştırabilir neuroblasts bölünme hücreleri görüntü vurguluyor. Hücre-hücre iletişimi metazoan gelişimi ve C. sırasında doku oluşumu için önemlidir elegans in vivo doku oluşumunu incelemek için mükemmel bir model. Güzel dokuların etkileşimi canlandıran bir olay epitel hücrelerinin bir tabaka…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bu çalışma Doğa Bilimleri ve Kanada'nın (NSERC) hibe Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklenen olduğunu kabul etmek istiyorum.
Materials
| Agar | BioShop Canada Inc. | #AGR001.1 | For making C. elegans NGM and RNAi plates |
| Agar | Bio Basic Inc. | #9002-18-0 | For making bacteria LB agar plates |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | #AGA001.500 | |
| Anti-mouse Alexa 488 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11029 | |
| Anti-mouse anti-GFP antibody | Roche Applied Science | #11814460001 | |
| Anti-rabbit Alexa 568 antibody | Life Technologies Corporation (Invitrogen) | #A11011 | |
| Ampicillin | BioShop Canada Inc. | #AMP201.5 | Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C |
| Bactopetone (peptone-A) | Bio Basic Inc. | #G213 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | BioShop Canada Inc. | #C302.1 | |
| Cholesterol | BioShop Canada Inc. | #CHL380.25 | Dissolve in ethanol |
| DAPI | Sigma-Aldrich | #D9542 | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Glycerol | BioShop Canada Inc. | #GLY001.1 | |
| IPTG (isopropylthio-β-galactoside) | Bio Basic Inc. | #367-93-1 | Store powder and dissolved IPTG at -20 °C |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | BioShop Canada Inc. | #PPM666.1 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | BioShop Canada Inc. | #PPD303.1 | |
| L4440 (feeding vector) | Addgene | #1654 | Keep as glycerol stock at -80 °C |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | BioShop Canada Inc. | #MAG511.500 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | #7647-14-5 | |
| Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | #7558-79-4 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Wisent Bioproducts | #035-110 | |
| n-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoate (propyl gallate) | Alfa Aesar | #A10877 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | #P8920 | For optimal results coat microscope slides three times |
| Streptomycin | BioShop Canada Inc. | #STP101.50 | Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C |
| Tetracyclin | BioShop Canada Inc. | #TET701.10 | Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C |
| Tween-20 | Bio Basic Inc. | CAS#9005-64-5 | |
| Tryptone | BioShop Canada Inc. | #TRP402.500 | |
| Yeast Extract | Bio Basic Inc. | #8013-01-2 |
Referências
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77, 71-94 (1974).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- . C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Pennisi, E. Worming secrets from the C. elegans genome. Science. 282, 1972-1974 (1998).
- Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. . Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community. , 1-22 (2005).
- Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue. Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).
- Kiehart, D. P. Wound healing: the power of the purse string. Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).
- Ikegami, R., et al. Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans. Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).
- Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans. C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).
- Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph. Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).
- Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor. Development. 129, 5499-5510 (2002).
- Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis. Development. 132, 3679-3690 (2005).
- Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex. PLoS Genet. 8, (2012).
- Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. Cytokinesis: welcome to the Rho zone. Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).
- Piekny, A. J., Maddox, A. S. The myriad roles of Anillin during cytokinesis. Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).
- Zhao, W. M., Fang, G. Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis. J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).
- Piekny, A. J., Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis. Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).
- Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis. J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).
- Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Duerr, J. S. . Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community. , 1-61 (2006).
- Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo. Development. 132, 2837-2848 (2005).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).
- Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans. Trends Genet. 16, 544-551 (2000).
- Zhang, H., Labouesse, M. Signaling through mechanical inputs – a coordinated process. J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).
- Guenther, C., Garriga, G. Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates. Development. 122, 3509-3518 (1996).
- Audhya, A., et al. A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).
- Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow. Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).
- Dorn, J. F., et al. Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans. Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).
- Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).
