تقييم التقدم دورة الخلية الجذعية العصبية من الخلايا والسلف في تطوير الدماغ ماوس بعد الإجهاد السمية الوراثية
Summary
إدارة اثنين من النظير ثيميدين، ايدو وBrdU، في الفئران الحوامل يسمح للتحليل تطور دورة الخلية العصبية في والخلايا الاصلية في مخ الفأر الجنينية. وهذه الطريقة مفيدة لتحديد آثار الإجهاد السمية، بما في ذلك الإشعاعات المؤينة، أثناء نمو المخ.
Abstract
تتولد الخلايا العصبية في القشرة الدماغية أثناء نمو المخ من أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية العصبية والسلف (NSPC)، والتي تشكل ظهارة مطبقة كاذبة بطانة البطينات الجانبية من الدماغ الجنينية. الضغوط السمية، مثل الإشعاع المؤين، يكون لها آثار ضارة للغاية على الدماغ النامية فيما يتعلق حساسية عالية من NSPC. توضيح الآليات الخلوية والجزيئية تشارك يعتمد على توصيف استجابة الحمض النووي من التلف من هذه أنواع معينة من الخلايا، الأمر الذي يتطلب وسيلة دقيقة لتحديد NSPC التقدم من خلال دورة الخلية في الأنسجة التالفة. هنا يظهر أسلوب يستند على حقن داخل الصفاق المتعاقبة من ايدو وBrdU في الفئران الحوامل وكذلك الكشف عن هذه نظائرها ثيميدين اثنين في أقسام الاكليلية من الدماغ الجنينية. على حد سواء أدرجت ايدو وBrdU في الحمض النووي للخلايا تكرار خلال المرحلة S ويتم الكشف عنها من قبل اثنين من تقنيات مختلفة (أو أزيدالأجسام المضادة المحددة، على التوالي)، التي تسهل الكشف عنها في وقت واحد. EDU وBrdU تلطيخ ثم يتم تحديدها لكل نواة NSPC في وظيفة من المسافة التي تفصله عن الهامش البطين في المنطقة مستوى لل telencephalon الظهرية. وبالتالي هذه التقنية وضع العلامات مزدوج يسمح تمييز الخلايا التي تقدم من خلال دورة الخلية من تلك التي تم تنشيطها نقطة تفتيش دورة الخلية مما يؤدي إلى اعتقال دورة الخلية ردا على الحمض النووي من التلف.
ويرد مثال على التجربة، التي تم حقن EDU قبل التشعيع وBrdU مباشرة بعد وتحليلات أجريت داخل ساعة 4 التالية التشعيع. يوفر هذا البروتوكول تحليلا دقيقا للاستجابة حادة من الحمض النووي من التلف NSPC في وظيفة من مرحلة من مراحل دورة الخلية التي كانت قد تعرضت للإشعاع. هذه الطريقة بسهولة القابلة للنقل لكثير من النظم الأخرى من أجل تحديد أثر علاج خاص على تقدم دورة الخلية في الأنسجة الحية.
Introduction
أثناء نمو المخ الجنينية، يتم إنشاء الخلايا العصبية الإسقاط من قشرة الدماغ في منطقة البطين، وهي تتألف من ظهارة مطبقة كاذبة أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية العصبية والسلف (NSPC) أن خطوط البطينين الوحشي. بين NSPC، والخلايا الدبقية شعاعي (RGC)، والتي تكون بمثابة الخلايا الجذعية العصبية، والخضوع الهجرة النووية interkinetic (الحركة الوطنية العراقية): أنها تؤدي الانقسام على سطح البطين وS-المرحلة في حد القاعدية من منطقة البطين (VZ) 1، 2،3. يمكن يتقاسمونها إما بشكل متناظر لتوليد اثنين RGC أو غير متماثلة لتوليد RGC واحد والخلايا العصبية واحد أو خلية متوسطة السلف (IPC) 4، 5. IPC الهجرة إلى طبقة الفوقية المتكاثرة تسمى منطقة subventricular (SVZ)، حيث بعد تقسيم متماثل مشاركة واحدة أنها تولد اثنين من الخلايا العصبية الإسقاط غير ناضجة 6-8. خلافا للRGC، IPC لا تخضع الحركة الوطنية العراقية (مراجعة في 9). الخلايا العصبية ولدت حديثا migrأكلت شعاعيا على طول الألياف شعاعي من خلال منطقة وسطى (IZ) للوصول إلى وجهتهم النهائية في لوحة القشرية (CP) 10، 8. توقيت مثالي من كل هذه الأحداث أمر ضروري لتطوير القشرية الصحيح. على سبيل المثال يتم التحكم في التحول من الانتشار إلى التفريق بين السكان السلف العصبية قبل مدة المرحلة G1 11، 12. إطالة المرحلة G1 يرتبط بالتالي مع تمايز الخلايا.
الإجهاد السمية، مثل الإشعاع المؤين، نمو الدماغ يضعف بشدة (إعادة النظر في 13). نحن وآخرون أظهرت أن NSPC عرضة للغاية لالإشعاع الناجم عن موت الخلايا المبرمج 14، 15،16. الإشعاعات المؤينة لحث على الحمض النووي المزدوج فواصل حبلا التي هي أشد ضررا على الخلايا المتكاثرة. أحد المكونات الأساسية لاستجابة الحمض النووي من التلف (DDR) في الخلايا ركوب الدراجات هو تفعيل نقاط التفتيش في دورة الخلية G1 / S أو G2 / M التحولات أو أثناء Sالمرحلة (نقطة تفتيش داخل S) 17-21. انهم منع تطور دورة الخلية لتوفير الوقت لإصلاح التلف في الحمض النووي أو التخلص من الخلايا التالفة أيضا. بالتالي، موت الخلايا وكذلك تأخير تقدم دورة الخلية قد يغير نمو الدماغ ردا على التعرض للإشعاعات المؤينة 22-24. ولذا كان من المثير للاهتمام أن وضع طريقة لتقييم تفعيل نقاط التفتيش دورة الخلية في NSPC في مخ الفأر الجنينية المشع.
ويتبع تطور دورة الخلية بشكل روتيني باستخدام إدماج التناظرية ثيميدين، 5-برومو-2'-deoxyUridine (BrdU). أدرج BrdU خلال المرحلة S من دورة الخلية، عندما يتم تكرار الحمض النووي. استخدام الأجسام المضادة ضد BrdU يسمح بعد ذلك للكشف عن الخلايا التي كانت في المرحلة S خلال نبض BrdU.
يتم الكشف عن التناظرية ثيميدين الرواية، 5-إيثينيل-2'-deoxyUridine (EDU) من قبل أزيد الفلورسنت. الطرق المختلفة للكشف عن وباء EDU RDU لا تتفاعل عبر 25، وتمكن من الكشف في وقت واحد من كل من النظير ثيميدين، وهو أمر مفيد لدراسة تقدم دورة الخلية. وعادة ما تكون الخلايا الأولى مع نابض EDU ثم نابض مع BrdU، حيث الفترة الزمنية بين كل من المعلومات المدرجة تستمر بضع ساعات 25 و 26. إضافة BrdU في وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على EDU النتائج في تفضيلي إدماج BrdU في الحمض النووي مع استبعاد كل من ايدو، بينما في وقت واحد بالإضافة EDU 25 مع BrdU متساوي المولية أو نصف متساوي المولية لنتائج سائل الإعلام إلا في BrdU التأسيس 27. هذا يبسط بروتوكول وضع العلامات المزدوجة من خلال القضاء على خطوات غسل التي تكون مطلوبة عادة لإزالة التسمية الأولى من وسائل الإعلام الثقافة قبل إضافة التسمية الثانية. وهذا هو أيضا من اهتمام خاص لفي الجسم الحي الدراسة، حيث الخطوات الغسيل ليست ممكنة، لتحديد التوقيت الدقيق لدخول مرحلة S أو الخروج من سكان الخلية.
ر "> في الآونة الأخيرة، وقد تم تطوير وسيلة لوضع العلامات المزدوجة نبض في الدماغ الجنينية الماوس باستخدام EDU وBrdU 23، 24،22 لتحليل تطور دورة الخلية والحركة الوطنية العراقية من NSPC في الرحم بعد التشعيع. وعلاوة على ذلك فقد ثبت أنه، خلال المرحلة S، خلايا فأر تكرار أول المناطق كروماتين حقيقي ثم المغاير pericentric 28،29،30. ومن المثير للاهتمام، المغاير pericentric من الكروموسومات مختلفة تتجمع في نواة لتشكيل بؤر interphasic heterochromatic المعروف أيضا باسم chromocenters وكشفها بسهولة عن طريق تلطيخ دابي كما بؤر مشرق. لذلك، والفرق EDU وBrdU stainings من كروماتين حقيقي وchromocenters ساعدتنا على تحليل أكثر تحديدا المرحلة S تطور NSPC.يسمح هذا الأسلوب المظاهرة من النقص الواضح في نقطة تفتيش G1 / S في دعم البلاغات الوطنية 22-24، والذي يثير الدهشة تماما منذ يفترض هذا الحاجز أن تكون حاسمة للاستقرار الجينوم. عدة إكسبوقد استخدمت تصاميم erimental يعتمد على تركيبات مختلفة من ايدو BrdU والبقول لتحليل تقدم دورة الخلية في الدماغ الانتهائي بطني وظهري. هنا، نعطي مثالا على بروتوكولات السماح دراسة الحمض النووي من التلف الحاد في NSPC ضمن أول 4 ساعة التالية في الرحم تشعيع الأجنة E14.5 الماوس.
Protocol
Representative Results
Discussion
التصميم التجريبي وصفها هنا على أساس إدماج EDU 1.5 ساعة قبل التشعيع وإدماج BrdU مباشرة بعد التشعيع يسمح التظاهرة التي NSPCs قادرون على تفعيل S ونقاط التفتيش G2 / M ولكن لا حاجز G1 / S خلال شارع في ساعة 1 بعد الإجهاد سمية جينية في الدماغ الماوس الجنين. أجرينا التجارب الأخرى الت…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقت البحوث التي تؤدي إلى هذه النتائج على تمويل من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7/2007-2013) بموجب اتفاقية منحة رقم 323267، من كهرباء فرنسا (EDF) وL'من الوكالة الوطنية دي لا بحوث – سانتيه-للبيئة وآخرون سانتي-العناء (ANR-SEST، Neurorad).
Materials
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
Referências
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
