Avaliando a progressão do ciclo celular de tronco neurais e as células progenitoras no desenvolvimento do cérebro do rato após estresse genotóxico

Olivier Etienne; Amandine Bery; Telma Roque; Chantal Desmaze; François D. Boussin

doi:10.3791/51209

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Artigo de método

Avaliando a progressão do ciclo celular de tronco neurais e as células progenitoras no desenvolvimento do cérebro do rato após estresse genotóxico

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DOI:

10.3791/51209

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7 de maio de 2014

Olivier Etienne¹^,²^,³^,⁴ , Amandine Bery¹^,²^,³^,⁴ , Telma Roque¹^,²^,³^,⁴ , Chantal Desmaze¹^,²^,³^,⁴ , François D. Boussin¹^,²^,³^,⁴

¹Laboratoire de Radiopathologie, CEA DSV iRCM SCSR, ²INSERM, U967, ³Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, ⁴Université Paris Sud, UMR 967

Neste artigo

Resumo

A administração de dois análogos de timidina, EdU e BrdU, em ratinhas grávidas permite a análise da progressão do ciclo celular em células progenitoras neurais e no cérebro do rato embrionário. Este método é útil para determinar os efeitos do stress genotóxico, incluindo a radiação ionizante, durante o desenvolvimento do cérebro.

Resumo

Os neurónios do córtex cerebral são gerados durante o desenvolvimento do cérebro a partir de diferentes tipos de células estaminais e progenitoras neurais (NSPC), que formam um epitélio pseudo alinhando os ventrículos laterais do cérebro embrionário. Estresses genotóxicos, como a radiação ionizante, têm efeitos altamente deletérios sobre o cérebro em desenvolvimento relacionado com a alta sensibilidade do NSPC. A elucidação dos mecanismos celulares e moleculares envolvidas depende da caracterização da resposta a danos no ADN destes tipos particulares de células, o que requer um método preciso para determinar a progressão NSPC longo do ciclo celular no tecido danificado. Aqui é mostrado um método baseado em sucessivas injeções intraperitoneais Edu e BrdU em camundongos grávidas e ainda a detecção destes dois análogos da timidina em cortes coronais do cérebro embrionário. EdU BrdU e ambos são incorporados no ADN das células em replicação durante a fase S e são detectados através de duas técnicas diferentes (ou azidaum anticorpo específico, respectivamente), que facilitam a sua detecção simultânea. EdU e coloração BrdU são então determinados para cada núcleo NSPC em função da sua distância a partir da margem do ventrículo numa região padrão do telencéfalo dorsal. Assim, esta técnica de marcação dupla permite distinguir células que progrediu ao longo do ciclo celular das que ter activado um checkpoint do ciclo celular, levando à paragem do ciclo celular em resposta ao dano do DNA.

Um exemplo de experimento é apresentado, no qual EdU foi injetado antes da irradiação e BrdU imediatamente após e análises realizadas no âmbito da 4 h após a irradiação. Este protocolo apresenta uma análise precisa da resposta de dano de DNA aguda de NSPC em função da fase do ciclo celular em que eles foram irradiadas. Este método é facilmente transponível para muitos outros sistemas, a fim de determinar os efeitos de um tratamento específico sobre a progressão do ciclo celular em tecidos vivos.

Introdução

Durante o desenvolvimento do cérebro embrionário, de neurónios de projecção do córtex cerebral são gerados na zona ventricular, um epitélio pseudo composto de diferentes tipos de estaminais neuronais e células progenitoras (NSPC) que reveste os ventrículos laterais. Entre NSPC, as células gliais radiais (RGC), que servem como células estaminais neurais, sofrer migração nuclear interkinetic (INM): eles realizam a mitose na superfície do ventrículo e da fase S no limite basal da zona ventricular (VZ) ^{1, 2,3.} Eles podem dividir ou simetricamente para gerar dois RGC ou assimetricamente para gerar um RGC e um neurônio ou uma célula intermediária progenitor (IPC....