Het beoordelen van de celcyclus van neurale stamcellen en stamcellen in de Mouse ontwikkeling van de hersenen na genotoxische stress
Summary
Toediening van twee analogen van thymidine, Edu en BrdU, bij zwangere muizen maakt de analyse van de celcyclus en in neurale voorlopercellen in de embryonale hersenen van muizen. Deze werkwijze is nuttig om de effecten van genotoxische stress, zoals ioniserende straling, tijdens de hersenontwikkeling bepalen.
Abstract
Neuronen van de cerebrale cortex ontstaan tijdens hersenontwikkeling van verschillende soorten neurale stamcellen en progenitorcellen (NSPC), die een pseudo-epitheel langs de laterale ventrikels van de embryonale hersenen vormen. Genotoxisch benadrukt, zoals ioniserende straling, hebben zeer schadelijke effecten op de ontwikkelende hersenen verband met de hoge gevoeligheid van NSPC. Opheldering van de cellulaire en moleculaire mechanismen afhankelijk van de karakterisering van de DNA schade respons van deze specifieke soorten cellen, die een nauwkeurige methode vereist NSPC progressie bepalen door de celcyclus in het beschadigde weefsel. Hier wordt een methode waarbij opeenvolgende intraperitoneale injecties van Edu en BrdU bij zwangere muizen en verdere detectie van deze twee thymidine analogen coronale secties van de embryonale hersenen. Edu en BrdU zijn beide opgenomen in DNA van replicerende cellen in S-fase en worden gedetecteerd door twee verschillende technieken (azide ofeen specifiek antilichaam, respectievelijk), die de gelijktijdige detectie vergemakkelijken. Edu en BrdU kleuring worden vervolgens voor elk NSPC kern als functie van de afstand van de ventriculaire marge in een standaard deel van de dorsale telencephalon. Dus deze dubbele labeling techniek kan onderscheiden cellen die doorliep de celcyclus van degenen die een celcyclus leidt tot celcyclus geactiveerd in respons op DNA beschadiging.
Een voorbeeld van een experiment wordt gepresenteerd, waarin Edu voor de bestraling en BrdU werd geïnjecteerd onmiddellijk na en analyses uitgevoerd binnen de 4 uur na bestraling. Dit protocol geeft een nauwkeurige analyse van de acute DNA schade respons van NSPC in functie van de fase van de celcyclus waarin zij zijn bestraald. Deze methode gemakkelijk worden toegepast op vele andere systemen om het effect van een bepaalde behandeling op celcyclusprogressie in levende weefsels te bepalen.
Introduction
Tijdens de embryonale ontwikkeling van de hersenen, zijn projectie neuronen van de cerebrale cortex opgewekt in de ventriculaire zone, een pseudo-epitheel uit verschillende soorten neurale stamcellen en progenitorcellen (NSPC) lijnen die de laterale ventrikels. Onder NSPC de radiale gliacellen (RGC), die als neurale stamcellen ondergaan interkinetic nucleaire migratie (INM) die mitose treden op het oppervlak van het ventrikel en S-fase bij de basale grens van de ventriculaire zone (VZ) 1, 2,3. Ze kunnen ofwel symmetrisch verdelen twee RGC genereren of asymmetrisch een RGC en een neuron of een tussenproduct progenitor cel (IPC) 4, 5 genereren. IPC migreren naar een bovenliggende uitdijende laag genaamd subventriculaire zone (SVZ), waarna een laatste symmetrische verdeling genereren ze twee onvolwassen projectie neuronen 6-8. In tegenstelling tot RGC, hoeft IPC ondergaan INM (beoordeeld 9). Nieuw gegenereerde neuronen migraten radiaal langs de radiale vezels via de tussenliggende zone (IZ) naar hun eindbestemming te bereiken in de corticale plaat (CP) 10, 8. De perfecte timing van al deze gebeurtenissen is essentieel voor een goede ontwikkeling van de hersenschors. Bijvoorbeeld de overgang van proliferatie differentiatie van neurale populaties wordt geregeld door de G1 faseduur 11, 12. De verlenging van de G1 fase correleert dus met celdifferentiatie.
Genotoxische stress, zoals ioniserende straling, ernstige aantasting hersenontwikkeling (besproken in 13). Wij en anderen hebben aangetoond dat NSPC zijn zeer gevoelig voor straling geïnduceerde apoptose 14, 15,16. Ioniserende straling veroorzaken DNA dubbelstrengs breuken die het meest ernstige schade aan delende cellen. Een essentieel onderdeel van DNA-schade Response (DDR) in delende cellen is de activering van de celcyclus checkpoints op de G1 / S of G2 / M overgangen of tijdens Sfase (intra-S checkpoint) 17-21. Ze blokkeren de voortgang van de celcyclus te tijd te geven voor DNA-schadeherstel of eliminatie van te beschadigde cellen. Bijgevolg kan celdood en vertraagde celcyclusprogressie hersenontwikkeling veranderen in reactie op ioniserende straling 22-24. Het was dus interessant om een werkwijze voor de activering van celcyclus in NSPC in de bestraalde muis embryonale hersenen beoordelen.
De progressie van de celcyclus wordt routinematig gevolgd met de opname van een thymidine analoog, 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU). BrdU opgenomen in de S-fase van de celcyclus, bij DNA replicatie. Het gebruik van een antilichaam tegen BrdU kan daarna de detectie van cellen die gedurende de puls van BrdU in S-fase waren.
Een nieuw thymidine analoog, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EDU) wordt gedetecteerd door een fluorescerende azide. De verschillende manieren om te detecteren EDU en B RDU geen kruisreactie 25, die gelijktijdige detectie van thymidine analogen, die nuttig is voor de studie van de celcyclus. Meestal cellen worden eerst gepulst met Edu en vervolgens gepulseerd met BrdU, waarbij het tijdsverloop tussen beide oprichtingen duurt paar uur 25, 26. Toevoeging van BrdU in kweekmedia die edu leidt voorkeur opname van BrdU in het DNA met uitzondering van EDE, terwijl gelijktijdige toevoeging van edu 25 met equimolaire of halve equimolaire BrdU de media resultaten slechts BrdU incorporatie 27. Dit vereenvoudigt de dubbele labeling protocol door eliminatie van de wasstappen die normaal nodig zijn om het eerste label van het kweekmedium voorafgaand aan de toevoeging van het tweede label te verwijderen. Dit is ook van bijzonder belang zijn voor in vivo onderzoek, waar de was-niet mogelijk zijn, om de precieze timing van de S-fase-of uitreis van de cel bevolking te bepalen.
t "> Onlangs, een werkwijze dual-pulse labeling embryonale muizenhersenen met edu en BrdU 23, 24,22 is ontwikkeld om celcyclusprogressie en INM van NSPC onderzoeken na de bestraling in utero. Bovendien is aangetoond dat bij S-fase, muis cellen repliceren eerst de euchromatin regio en vervolgens de pericentric heterochromatin 28,29,30. Interessant pericentric heterochromatin van verschillende chromosomen geclusterd in interfase kernen te heterochromatic brandpunten ook wel bekend als chromocenters en gemakkelijk door DAPI kleuring zo helder brandpunten vormen. Daarom is de differentiële Edu en BrdU kleuringen van euchromatine en chromocenters ons geholpen om meer precies S-fase progressie van NSPC analyseren.Deze methode kon de demonstratie van het schijnbare gebrek aan G1 / S checkpoint in NSCP 22-24, dat is heel verrassend aangezien dit ijkpunt zou van cruciaal belang voor stabiliteit van het genoom te zijn. Verschillende experimental ontwerpen op basis van verschillende combinaties van onderwijs en BrdU pulsen gebruikt om celcyclusprogressie te analyseren in de ventrale en dorsale telencephalon. Hier geven we een voorbeeld van protocollen waardoor de studie van de acute DNA schade NSPC binnen de eerste 4 uur na bestraling in utero van E14.5 muizenembryo's.
Protocol
Representative Results
Discussion
De proefopzet hier beschreven gebaseerd op integratie van Edu 1,5 uur voor de bestraling en incorporatie van BrdU onmiddellijk na bestraling toegestaan de demonstratie die NSPCs kunnen S en G2 / M checkpoints te activeren, maar niet de G1 / S checkpoint tijdens de 1 e uur na een genotoxische stress in de foetale hersenen van muizen. We voerden andere experimenten waarin Edu is geïnjecteerd op verschillende tijdstippen na bestraling en BrdU, op slechts 1 uur voor muizen offers, waardoor we specifiek waa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek dat leidt tot deze resultaten heeft financiering van de Europese Unie Zevende Kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder subsidieovereenkomst ontvangen n ° 323267, van Electricite de France (EDF) en van l'Agence Nationale de la Recherche – Sante-Environnement et Sante-Travail (ANR-minst goed zichtbaar, Neurorad).
Materials
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
Referências
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
