神経幹細胞の細胞周期の進行を評価し、マウスでの前駆細胞は、遺伝毒性ストレス後の脳の開発
Summary
妊娠マウスにおけるチミジンのEdUおよびBrdUの二類似体の投与は、胚性マウス脳の神経細胞および前駆細胞における細胞周期進行の分析を可能にする。この方法は、脳の発達の間に、電離放射線を含む遺伝毒性ストレスの効果を決定するために有用である。
Abstract
大脳皮質の神経細胞は、胚の脳の側脳室の内側を覆う多列上皮を形成し、神経幹細胞および前駆細胞の様々なタイプ（NSPC）から脳の発達の間に生成される。このような電離放射線などの遺伝毒性ストレスは、NSPCの高感度に関係する脳の発達に大きく悪影響を及ぼす。関与する細胞および分子機構の解明は、損傷した組織における細胞周期を通してNSPCの進行を決定する正確な方法を必要とする細胞のこれらの特定の種類のDNA損傷応答の特性に依存する。ここで妊娠マウス胚性脳の冠状断面におけるこれら2チミジン類似体の更なる検出においてのEdUおよびBrdUの連続腹腔内注射に基づく方法が示されている。のEdUおよびBrdUの両方S期の間複製細胞のDNAに組み込まれ、2つの異なる技術（又はアジドによって検出されるそれらの同時検出を容易に特異的な抗体、それぞれ）。のEdUとBrdU染色は、その後、背側終脳の標準領域における心室余白からの距離の関数で各NSPC核について決定される。したがって、この二重標識技術は、DNA損傷に応答して細胞周期の停止をもたらす細胞周期チェックポイントを活性化したものから、細胞周期を通して進行する細胞を区別することができる。
実験の例はEdUのは直後に、照射およびBrdUの前に注入し、照射後4時間以内に行わ分析する、提示されている。このプロトコルは、それらが照射された時に細胞周期の位相の関数でNSPCの急性DNA損傷応答の正確な分析を提供する。この方法は、生体組織中の細胞周期の進行に対する特定の治療の影響を決定するために容易に転移他の多くのシステムにある。
Introduction
胚の脳の発達の際に、大脳皮質の投射ニューロンは、神経幹細胞および前駆細胞（NSPC）の様々なタイプで構成多列上皮はそのライン側脳室、脳室帯で生成されます。 NSPC、神経幹細胞として機能する放射状グリア細胞（RGC）の中で、interkinetic核移行（INM）を受ける：彼らは脳室帯（VZ）の基底限界で心室とS相の表面で有糸分裂を行う1、2,3。彼らはどちらか分けることができる対称的に2 RGCを発生させるか、非対称に1 RGCと1ニューロンまたは中間前駆細胞（IPC）4、5を生成する。 IPCは1、最後の対称分裂後、彼らは2未熟投射ニューロン6-8を生成する脳室下帯（SVZ）と呼ばれるその上に増殖層に移行します。 RGCに反して、IPCは（9に概説されている）INMを受けない。新しく生成されたニューロンMIGR皮質板（CP）10、8で最終的な宛先に到達するために中間ゾーン（IZ）を介してラジアル繊維に沿って放射状に食べました。すべてのこれらのイベントの完璧なタイミングが正しい皮質発達に必須である。例えば、神経前駆細胞集団の分化増殖のスイッチは、G1期の持続11,12によって制御される。 G1期の延長は、細胞の分化と相関するこうして。
このような（13に概説されている）、電離放射線、ひどく損なう脳の発達などの遺伝毒性ストレス、。私たちは、他はNSPCは、放射線誘導性アポトーシス14、15,16に非常に傾向があることが示されている。電離放射線は、増殖している細胞に最も深刻な被害であるDNA二本鎖切断を誘導する。サイクリング細胞におけるDNA損傷応答（DDR）の一つの必須成分は、G1 / SまたはG2 / M遷移における又はSの間の細胞周期チェックポイントの活性化である相（イントラSチェックポイント）17〜21。それらは、DNA損傷修復すぎたり損傷を受けた細胞の排除のための時間を提供するために、細胞周期の進行をブロックする。従って、細胞死、ならびに遅延、細胞周期の進行は、放射線曝露22-24電離に応答して、脳の発達を変更することができる。これは、照射したマウス胚性脳におけるNSPCにおける細胞周期チェックポイントの活性化を評価するための方法を開発することは興味深かった。
細胞周期の進行は、定期的に、チミジン類似体、5 – ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）の取り込みを使用して追跡する。 DNAが複製されるときにBrdUは、細胞周期のS期の間に組み込まれる。のBrdUに対する抗体の使用は、その後のBrdUのパルスの間にS期にある細胞の検出を可能にする。
新規のチミジン類似体、5 – エチニル-2'-デオキシウリジン（EdUの）は、蛍光アジドによって検出される。のEdUとBを検出するために様々な方法 RDUは、細胞周期の進行の研究に有用である両方のチミジン類似体の同時検出を可能にする、25に交差反応しない。通常の細胞は最初のEdUをパルスした後、両方の取り込み間の時間は、時間25、26のカップルを持続するのBrdUでパルスする。唯一のBrdUの取り込み27のメディアの結果と等モルまたはハーフモルBrdUによるEdUの25の同時添加しながら、EdUを排除してDNAへのBrdUの取り込みを優先におけるEdUの結果を含む培養培地中のBrdUの追加。これは、通常、前に第二の標識の添加培地から最初のラベルを削除するために必要とされる洗浄ステップを排除することによって、二重標識プロトコルを簡素化します。これはまた、細胞集団のS期の出入りの正確なタイミングを決定するために、洗浄工程が不可能なインビボ研究のために特に重要である。
t "の>最近、EdUのおよびBrdU 23、24,22を用いて、胚性マウス脳におけるデュアルパルス標識する方法は、 子宮内照射における後の細胞周期の進行およびNSPCのINMを分析するために開発された。また、それが実証されている間に、そのS期は、マウスの細胞をまずユークロマチン領域とし、ペリセントリックヘテロクロマチン28,29,30を複製します。興味深いことに、interphasic核内にクラスタ化された異なる染色体の挟動原体ヘテロクロマチンもchromocentersとして知られており、鮮やかな焦点とDAPI染色によって容易に検出可能なヘテロクロマチンフォーカスを形成する。そのため、ユークロマチンとchromocentersの差分のEdUおよびBrdU染色をより正確にNSPCのS期の進行を分析するために、私たちを助けた。このメソッドは、このチェックポイントがゲノムの安定性にとって重要であると考えられるので、非常に驚くべきことであるNSCP 22〜24でのG1 / Sチェックポイントの見かけの欠如、のデモを許可された。いくつかのEXPのEdUおよびBrdUパルスのさまざまな組み合わせに基づいて、erimental設計は、腹側と背側終脳における細胞周期の進行を分析するために使用されてきた。ここでは、E14.5マウス胚の子宮内照射に続く最初の4時間以内でNSPCの急性DNA損傷の研究を可能にするプロトコルの例を与える。
Protocol
Representative Results
Discussion
のEdU 1.5時間の取り込みに基づいてここで説明する実験計画の前に照射が許可された直後に照射し、BrdUの取り込みNSPCsの後、SおよびG2 / Mチェックポイントを活性化することができるが、1 回目の時間の間に、G1 / Sチェックポイントではありませんデモ胎児のマウス脳における遺伝毒性ストレス。私たちは、私たちは、特にS期のエントリの割合を鑑賞することができ、EdUのはちょうど1?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
これらの結果につながる研究がグラント契約の下で、欧州連合（EU）セブンス枠組み計画（FP7/2007-2013）から資金提供を受けたNフランス電力（EDF）からとL'アジャン国立·デ·ラ·ルシェルシュから、323267を°ました – サンテ·エンバらサンテ – 苦労（ANR-SEST、Neurorad）。
Materials
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
Referências
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