Valutare progressione del ciclo cellulare delle staminali e cellule progenitrici del cervello di sviluppo del mouse dopo stress genotossico
Summary
La somministrazione di due analoghi della timidina, EdU e BrdU, nei topi in gravidanza permette l'analisi della progressione del ciclo cellulare in cellule progenitrici neurali e nel cervello embrionale mouse. Questo metodo è utile per determinare gli effetti dello stress genotossico, incluse le radiazioni ionizzanti, durante lo sviluppo del cervello.
Abstract
Neuroni della corteccia cerebrale sono generati durante lo sviluppo cerebrale da diversi tipi di cellule staminali e progenitrici neurali (NSPC), che formano un epitelio pseudostratificato rivestimento ventricoli laterali del cervello embrionale. Stress genotossici, come le radiazioni ionizzanti, hanno effetti estremamente deleteri sullo sviluppo del cervello connesse con l'elevata sensibilità di NSPC. Delucidazione dei meccanismi cellulari e molecolari coinvolti dipende dalla caratterizzazione della risposta al danno del DNA di questi particolari tipi di cellule, che richiede un metodo preciso per determinare NSPC progressione attraverso il ciclo cellulare nel tessuto danneggiato. Qui viene mostrato un metodo basato su successive iniezioni intraperitoneali di EdU e BrdU nei topi in gravidanza e ulteriore rilevazione di questi due analoghi della timidina nelle sezioni coronali del cervello embrionale. EdU e BrdU sono entrambi incorporati nel DNA delle cellule si replicano durante la fase S e sono rilevate da due diverse tecniche (azide oun anticorpo specifico, rispettivamente), che facilita il loro rilevamento simultaneo. EdU e BrdU colorazione sono quindi determinate per ciascun nucleo NSPC in funzione della sua distanza dal margine ventricolare in una regione standard del telencefalo dorsale. Così questa tecnica dual etichettatura permette distinguere cellule che avanti attraverso il ciclo cellulare da coloro che hanno attivato un punto di controllo del ciclo cellulare che porta all'arresto del ciclo cellulare in risposta al danno del DNA.
Un esempio di esperimento viene presentato, in cui EdU stato iniettato prima dell'irraggiamento e BrdU immediatamente dopo e analisi effettuata all'interno del 4 ore dopo irradiazione. Questo protocollo fornisce un'analisi accurata della risposta al danno del DNA acuta di NSPC in funzione della fase del ciclo cellulare in cui sono stati irradiati. Questo metodo è facilmente trasponibile a molti altri sistemi per determinare l'impatto di un particolare trattamento sulla progressione del ciclo cellulare nei tessuti viventi.
Introduction
Durante lo sviluppo embrionale del cervello, neuroni di proiezione della corteccia cerebrale sono generati nella zona ventricolare, un epitelio pseudostratificato composto da diversi tipi di staminali neurali e cellule progenitrici (NSPC) che riveste le ventricoli laterali. Tra NSPC, le cellule gliali radiali (RGC), che servono come le cellule staminali neuronali, subiscono migrazione nucleare interkinetic (INM): eseguono mitosi alla superficie del ventricolo e fase S al limite basale della zona ventricolare (VZ) 1, 2,3. Essi possono suddividere simmetricamente per generare due RGC o asimmetricamente per generare un RGC e un neurone o una cellula intermedia progenitore (IPC) 4, 5. IPC migrare verso uno strato sovrastante proliferare chiamata zona subventricolare (SVZ), dove, dopo un ultimo divisione simmetrica che generano due neuroni di proiezione immaturi 6-8. Contrariamente a RGC, IPC non subiscono INM (recensito in 9). Neuroni appena generati Migrmangiato radialmente lungo le fibre radiali attraverso la zona intermedia (IZ) per raggiungere la destinazione finale nella piastra corticale (CP) 10, 8. Il tempismo perfetto di tutti questi eventi è essenziale per un corretto sviluppo corticale. Per esempio l'interruttore dalla proliferazione di differenziazione delle popolazioni progenitrici neurali è controllata dalla durata della fase G1 11, 12. L'allungamento della fase G1 correla quindi con differenziazione cellulare.
Stress genotossico, come le radiazioni ionizzanti, lo sviluppo del cervello compromettere gravemente (rivisto nel 13). Noi e altri abbiamo dimostrato che NSPC sono molto inclini a radiazione indotta l'apoptosi 14, 15,16. Le radiazioni ionizzanti inducono rotture del DNA doppie che sono i danni più gravi alle cellule proliferanti. Una componente essenziale della risposta al danno al DNA (DDR) nelle cellule ciclismo è l'attivazione di punti di controllo del ciclo cellulare ai G1 / S o G2 / M transizioni o durante Sfase (intra-S checkpoint) 17-21. Bloccano la progressione del ciclo cellulare per fornire il tempo per riparare i danni del DNA o eliminazione delle cellule troppo danneggiate. Di conseguenza, la morte cellulare e la progressione del ciclo cellulare ritardato possono alterare lo sviluppo del cervello in risposta a esposizione a radiazioni ionizzanti 22-24. Era quindi interessante sviluppare un metodo per valutare l'attivazione di punti di controllo del ciclo cellulare in NSPC nel topo cervello embrionale irradiato.
La progressione del ciclo cellulare è ordinariamente seguita mediante l'incorporazione di un analogo della timidina, 5-Bromo-2'-deossiuridina (BrdU). BrdU viene incorporata nella fase S del ciclo cellulare, quando il DNA si replica. L'uso di un anticorpo contro BrdU permette successivamente la rilevazione di cellule che erano in fase S durante l'impulso di BrdU.
Un analogico timidina romanzo, 5-etinil-2'-deossiuridina (UDE) è rilevata da un azide fluorescente. I diversi modi per rilevare EdU e B RDU non cross-reagisce 25, consentendo il rilevamento simultaneo di entrambe analoghi della timidina, che è utile per lo studio della progressione del ciclo cellulare. Solitamente le cellule vengono prima pulsate con EdU e poi pulsate con BrdU, dove il tempo tra due incorporazioni dura paio d'ore 25, 26. Aggiunta di BrdU in mezzi di coltura contenente EdU provoca preferenzialmente incorporazione di BrdU nel DNA con l'esclusione di EdU, mentre aggiunta simultanea di EdU 25 con BrdU equimolare o mezza equimolare ai risultati di media in solo incorporazione di BrdU 27. Questo semplifica il protocollo dual etichettatura eliminando le fasi di lavaggio che normalmente necessari per rimuovere la prima etichetta dal supporto di coltura prima dell'aggiunta della seconda etichetta. Ciò è di particolare interesse per lo studio in vivo, in cui le fasi di lavaggio non sono possibili, per determinare il tempo esatto della fase S entrata o di uscita della popolazione cellulare.
t "> Recentemente, è stato sviluppato un metodo di etichettatura con doppia impulsi in cervello di topo embrionale utilizzando EdU e BrdU 23, 24,22 per analizzare la progressione del ciclo cellulare e INM di NSPC dopo irradiazione in utero. Inoltre è stato dimostrato che, durante fase S, cellule di topo replicare prima le regioni eucromatina e poi il heterochromatin pericentrica 28,29,30. interessante, eterocromatina pericentrica di diversi cromosomi raggruppati in nuclei interfasiche per formare foci eterocromatico noto anche come chromocenters e facilmente rilevabile con colorazione DAPI come foci brillante. Pertanto, i differenziali Edu e BrdU colorazioni di euchromatin e chromocenters ci ha aiutato ad analizzare con maggiore precisione la progressione fase S di NSPC.Questo metodo ha permesso la dimostrazione della apparente mancanza di G1 / S checkpoint in NSCP 22-24, che è abbastanza sorprendente, dal momento che questo checkpoint dovrebbe essere critica per la stabilità del genoma. Diversi expdisegni erimental basati su diverse combinazioni di Edu e BrdU impulsi sono stati utilizzati per analizzare la progressione del ciclo cellulare nel telencefalo ventrale e dorsale. Qui, diamo un esempio di protocolli per lo studio del danno al DNA acuta NSPC all'interno dei primi 4 hr seguente irradiazione in utero di embrioni di topo E14.5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il disegno sperimentale qui descritto sulla base di incorporazione di EdU 1,5 ore prima dell'irraggiamento e l'incorporazione di BrdU subito dopo l'irradiazione ha permesso la dimostrazione che NSPCs sono in grado di attivare S e checkpoint G2 / M, ma non il checkpoint G1 / S durante la 1 ° ora dopo un stress genotossico nel cervello fetale mouse. Abbiamo eseguito altri esperimenti in cui EdU è stato iniettato in tempi diversi dopo l'irraggiamento e BrdU, a solo 1 ora prima topi sacrifici, c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Settimo programma quadro dell'Unione europea (FP7/2007-2013) in convenzione di sovvenzione n ° 323.267, da Electricité de France (EDF) e da L'Agence Nationale de la Recherche – Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
Referências
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