העברת רחם-תובל עובר ועיקור במודל העכבר
Summary
העברת עובר ברחם, חצוצרות משתמשת בצומת הרחם-חצוצרות כמחסום כדי למנוע את יצוא העובר שעלול להתרחש בעת ביצוע העברה ברחם. זכרים שעוקרו נדרשים להשיג מקבלי pseudopregnant לעוברים. שני הטכניקות הם דנו.
Abstract
העברת עוברי preimplantation לנקבה פונדקאית היא צעד הנדרש לייצורם של עכברים מהונדסים גנטי או כדי לחקור את ההשפעות של שינויים אפיגנטיים מקורו במהלך פיתוח preimplantation על בריאות פיתוח ומבוגר עוברית שלאחר מכן. השימוש בטכניקת העברת עובר יעילה ועקבית הוא חיונית כדי לשפר את הדור של בעלי חיים מהונדסים גנטי ועל מנת לקבוע את ההשפעה של טיפולים שונים על שיעורי השרשה והישרדות לטווח. עוברים בשלב הבלסטוציסט בדרך כלל מועברים על ידי העברת רחם, ביצוע לנקב בדופן הרחם להציג פיפטה המניפולציה עובר. פתח שבוצע ברחם אינו נסגר לאחר פיפטה בוטלה, והעוברים יכולים יצוא לחלל הבטן עקב הלחץ החיובי של הרחם. לנקב יכול גם לייצר דימום הפוגע בהשתלה, בלוקים טפטפת ההעברה ועלולה להשפיע על עובר דevelopment, במיוחד כאשר עובר ללא Zona מועברים. כתוצאה מכך, טכניקה זו לעתים קרובות תוצאות בשיעורי הישרדות עובר נמוך מאוד משתנים וכוללים. הימנעות השפעות השליליות אלה, העברת עובר ברחם, חצוצרות לנצל את צומת רחם-חצוצרות כמחסום טבעי המונע יצוא עובר ולהימנע מניקוב דופן הרחם. זכרים שעוקרו נדרשים לקבלת מקבלי pseudopregnant. טכניקה לביצוע ניתוח עיקור מתוארת כהשלמה לעוברים ברחם, חצוצרות.
Introduction
חזרת עוברים הוא כנראה ההליך הכירורגי השכיח ביותר שבוצע במודל העכבר. טכניקה זו היא חיונית כדי להשיג צאצאים מעוברים נתון במבחנה טכניקות מניפולציה, ולכן מהווה צעד הכרחי לפיתוח של מודלים מהונדסים גנטי על ידי הזרקת pronuclear, התמרה lentiviral, או היווצרות הכימרה. חוץ מזה, הטכניקה מאפשרת הלימוד של ההשפעות התפתחותיות של עלבונות מגוונים המתרחשים במהלך התפתחות preimplantation. השימוש בטכניקות מלאכותיות רבייה 1 או החשיפה לריכוזים חריגים של חומרים או מטבוליטים 2 שונים עשוי להשפיע על התפתחות עובר וכתוצאה מכישלונות השתלה או placentation והשפעות ארוך טווח בצאצאים. טכניקת חזרת עוברים אמינה לשחזור היא חיונית כדי לבדוק את ההשפעות שליליות האפשרית של טיפול ניסיוני בהשתלה והתפתחות העובר באדם עקבינר.
ניתן להעביר עוברי preimplantation Murine לנקבת נמען או לתוך oviduct באמצעות ampullae פוסט 0.5 ימים coitum הנמענים (DPC) pseudopregnant (העברת oviduct) 3,4 או לתוך הרחם של 2.5 נמען pseudopregnant DPC (העברת רחם) 5,6 בהתאם לשלב ההתפתחותי שלהם. עוברים בשלב הבלסטוציסט, כגון אלו המשמשים ליצירת עכברי chimeric על ידי הזרקה של תאי גזע pluripotent עובריים או מושרה, הם מועברים בדרך כלל על ידי העברת רחם. יכול גם להיות מועבר בלסטוציטים לoviduct של נמען DPC 0.5, אבל היא מהווה מבחן פחות פיסיולוגי למשבשים התפתחותי, כי העובר עובר diapause ויש לו 2 ימים להתאושש מהעלבון לפני ההשתלה מתרחשת. העברה ברחם כרוכה ניקוב דופן הרחם בעזרת מחט צרה על מנת ליצור הפתח המאפשר הגישה של פיפטה מניפולציה עובר לתוך לומן הרחם.lthough טכניקה זו יכולה להניב תוצאות טובות, ההישרדות לטווח (כלומר אחוז העוברים הועברו המתפתחים לגור) היא לעתים קרובות נמוכה ובלתי צפוי 7,8.
ניקוב דופן הרחם כרוך כמה תופעות לוואי מזיקות. ראשית, myometrium היא רקמת vascularized מאוד ולנקבה לעתים קרובות תוצאות דימום קטן. דם עלול לחסום את טפטפת העברת עובר או לפלוש ללומן רחם גרימת מוות עוברי ו / או כישלון השתלה. זה רלוונטי במיוחד כאשר עובר ללא Zona מועברים, כמו תאי הדם והפסולת יכולים לצרף לסטומרים. שנית, הפתיחה שבוצעה אינה חותמת אחרי העוברים הועברו, ולכן הם יכולים לזרום בחזרה דרך פתח ולהיות מגורשים לחלל הבטן, כאשר נפח גדול מדי כבר להכניס לתוך הרחם. העברת העובר ברחם, חצוצרות שתוארו במסמך זה לנצל את צומת הרחם-חצוצרות כדי לספק embryos לתוך הרחם ללא הצורך בניקוב דופן רחם ובכך להימנע מההשלכות השליליות שלה 9.
נקבות נמען pseudopregnant משמשות להעברת עובר מתקבלות על ידי הזדווגות טבעית עם זכרים עוקרו 8. הפרשות המכוננת המיוצרים על ידי זכר סטרילי נדרשות לרחם להפוך פתוח לעוברים שהועברו. כדי להשיג נמען, למקסימום של 2 נקבות של 8 שבועות עד 6 חודשים של גיל מונחים עם זכר שעוקר בשעתי אחר הצהריים. למחרת בבוקר, נשים נבדקות לנוכחות של תקע הזדווגות בנרתיק, סבך של חלבונים קרוש מנוזל הזרע הגברי. כהזדווגות מתרחשת בדרך כלל בחצות, היום של גילוי תוסף נרתיק נחשב 0.5 DPC. למרות שניתן לרכוש זכרים עוקרו מכמה ספקים, ההליך הכירורגי שתואר במסמך זה הוא קל יחסית ואינו דורש כל מכשירים נוספים מהנדרש להעברת עובר.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח העיקור הוא טכניקה כירורגית קדימה יחסית ישרה שאינו כרוכה בקשיים גדולים. כאשר חיטוי עם יוד povidone ואתנול לוודא כי השטיפה האחרונה (עם אתנול) מסירה יוד povidone, מכיוון שהוא עלול לגרום לגירוי הצפק. הגישה לצינור זרע גם יכולה להיות מושגת על ידי שק האשכים או ביצוע חתך רו…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מהמחלקה למדעי בעלי חיים ועופות לBT.
Materials
| Ketamine | VEDCO | Ketaved ANADA 200-257 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Xylazine | Lloyd laboratories | Anased NADA #139-236 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buprenorphine | Generic | NDC 400-42-010-01 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Eye ointment | Novartis | Genteal | |
| Antibiotic | Pfizer | Clavamox NADA #55-101. | Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water. |
| Dressing serrated forceps | ROBOZ | RS-8120 | Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work. |
| Micro dissecting serrated forceps | ROBOZ | RS-5137 | These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred. |
| Slight curved micro dissection forceps | ROBOZ | RS-5136 | This model is particularly useful to hold the oviduct. |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| 27G needles | Beckton-Dickinson | 305136 | Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big. |
| Clip applier | MiKRon | 42763 | |
| 9 mm Clips | MiKRon | 427631 | |
| Clip remover | MiKRon | 7637 | Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead. |
| Suture needle holder | ROBOZ | RS-7820 | |
| Suture | Dowist Gell | 5-0 Dexon S 7204-21 | Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle. |
| Glass capillaries | VWR | 100 ul calibrated pipettes 53432-921 | It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8. |
| Burner | KISAG AG | Typ 2002 | Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame. |
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. |
| Fiber optics ilumination | Dolan Jenner | Fiber lite | To iluminate the surgical area. There are different systems available. |
| Warm stages | American scope | http://store.amscope.com/tcs-100.html | These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked. |
| Culture dishes for embryo manipulation | Falcon | 353001 | 351008 may be also used, they made narrower drops. |
Referências
- Fernandez-Gonzalez, R., et al. Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinting genes, development, and behavior. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 101, 5880-5885 (2004).
- Bermejo-Alvarez, P., Roberts, R. M., Rosenfeld, C. S. Effect of glucose concentration during in vitro culture of mouse embryos on development to blastocyst, success of embryo transfer, and litter sex ratio. 79, 329-336 (2012).
- Tarkowski, A. K. Experiments on the development of isolated blastomers of mouse eggs. Nature. 184, 1286-1287 (1959).
- Whittingham, D. G. Fertilization of mouse eggs in vitro. Nature. 220, 592-593 (1968).
- McLaren, A., Biggers, J. D. Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos. Nature. 182, 877-878 (1958).
- McLaren, A., Michie, D. Studies on the transfer of fertilized mouse eggs to uterine foster-mothers. I. Factors affecting the implantation and survival of native and transferred eggs. J. Exp. Biol. 33, 394-416 (1956).
- Goto, Y., et al. The fate of embryos transferred into the uterus. J. Assist. Reprod. Gen. 10, 197-201 (1993).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).
- Chin, H. J., Wang, C. K. Utero-tubal transfer of mouse embryos. Genesis. 30, 77-81 (2001).
- Ramirez, M. A., Fernandez-Gonzalez, R., Perez-Crespo, M., Pericuesta, E., Gutierrez-Adan, A. Effect of stem cell activation, culture media of manipulated embryos, and site of embryo transfer in the production of F0 embryonic stem cell mice. Biol. Reprod. 80, 1216-1222 (2009).
- Miller, A. M., Wright-Williams, S. L., Flecknell, P. A., Roughan, J. V. A comparison of abdominal and scrotal approach methods of vasectomy and the influence of analgesic treatment in laboratory mice. Lab. Anim. 46, 304-310 (2012).
- Flecknell, P. A. . Laboratory Animal Anaesthesia. , (2009).
- Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blumel, G. A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone ketamine-xylazine,carfentanyl-etomidate). Res. Exp. Med. 184, 159-169 (1984).
- Tarin, D., Sturdee, A. Surgical anaesthesia of mice: evaluation of tribromo-ethanol, ether, halothane and methoxyflurane and development of a reliable technique. Lab. Anim. 6, 79-84 (1972).
- Zeller, W., Meier, G., Burki, K., Panoussis, B. Adverse effects of tribromoethanol as used in the production of transgenic mice. Lab. Anim. 32, 407-413 (1998).
- Lieggi, C. C., et al. Efficacy and safety of stored and newly prepared tribromoethanol in ICR mice. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 17-22 (2005).
- Lieggi, C. C., et al. An evaluation of preparation methods and storage conditions of tribromoethanol. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 11-16 (2005).
- Meyer, R. E., Fish, R. E. A review of tribromoethanol anesthesia for production of genetically engineered mice and rats. Lab. Anim. 34, 47-52 (2005).
- Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biol. Reprod. 42, 432-440 (1990).
- Quinn, P., Barros, C., Whittingham, D. G. Preservation of hamster oocytes to assay the fertilizing capacity of human spermatozoa. J. Reprod. Fertil. 66, 161-168 (1982).
- Dios Hourcade, d. e., Perez-Crespo, J., Serrano, M., Gutierrez-Adan, A., A, B., Pintado, In vitro and in vivo development of mice morulae after storage in non-frozen conditions. Reprod. Biol. Endocrinol. 10, 62 (2012).
