Utero-Tubenembryotransfer und Vasektomie im Maus-Modell

Summary

Utero-Eileiter-Embryo-Transfer verwendet die utero-Eileiter-Kreuzung als Barriere, um den Embryo Abfluss, die bei der Durchführung von Uterus Übertragung auftreten können, zu verhindern. Vasektomierten Männchen sind erforderlich, um pseudo-Empfänger für Embryotransfer erhalten. Beide Techniken werden diskutiert.

Abstract

Die Übertragung der Präimplantationsembryonen zu einem Surrogat Frau ist ein erforderlicher Schritt für die Herstellung von genetisch veränderten Mäusen, um zu studieren oder die Auswirkungen von epigenetischen Veränderungen während Präimplantations Entwicklung bei zukünftigen Entwicklung des Fötus und Erwachsene Gesundheit entstanden ist. Die Verwendung einer wirksamen und kohärenten Embryo-Transfer-Technik ist entscheidend, um die Erzeugung von gentechnisch veränderten Tieren zu verbessern und die Wirkung der verschiedenen Behandlungen auf Implantationsraten und Überlebenszeit zu bestimmen. Embryos im Blastozysten-Stadium in der Regel durch Uterus Übertragung übertragen, Ausführen einer Punktion in der Uteruswand, die Embryomanipulation Pipette einzuführen. Die in der Gebärmutter durchgeführt Öffnung nicht schließen, nachdem die Pipette wurde zurückgezogen, und die Embryonen können Abfluss in die Bauchhöhle durch den Überdruck der Gebärmutter. Die Punktion kann auch produzieren eine Blutung, die Implantation beeinträchtigt, blockiert die Transferpipette und können Embryo d beeinflussenntwicklung, vor allem, wenn Embryonen ohne zona übertragen werden. Folglich ist diese Technik oft zu sehr variabel und insgesamt niedrigen Embryo-Überlebensraten. Die Vermeidung dieser negativen Auswirkungen, Eileiter-utero-Embryo-Transfer nutzen die utero-Eileiter-Kreuzung als eine natürliche Barriere, die Embryo Abfluss behindert und vermeiden Sie die Punktion der Gebärmutterwand. Vasektomierten Männer werden für den Erhalt schein Empfänger erforderlich. Eine Technik zur Vasektomie durchführen wird als Ergänzung zu den utero-Eileiter-Embryo-Transfer beschrieben.

Introduction

Embryotransfer ist wahrscheinlich der häufigste chirurgische Eingriff im Mausmodell durchgeführt. Diese Technik ist wesentlich, Nachkommen von Embryonen in vitro Manipulation Techniken unterworfen wurde, und daher stellt ein notwendiger Schritt für die Entwicklung von genetisch modifizierten Modelle von Vorkern-Injektion lentiviralen Transduktion oder Chimärenbildung. Außerdem ermöglicht die Technik die Untersuchung der Auswirkungen auf die Entwicklung von diversen Beleidigungen während der Präimplantations-Entwicklung auftreten. Die Verwendung von künstlichen Reproduktionstechniken ¹ oder der Einwirkung von abnormalen Konzentrationen verschiedener Stoffe oder Stoffwechsel ^{2. Mai} Embryonalentwicklung was Implantation oder Plazenta Ausfälle und langfristigen Auswirkungen bei den Nachkommen beeinflussen. Eine zuverlässige und reproduzierbare Embryo-Transfer-Technik ist entscheidend, um die möglichen negativen Auswirkungen der experimentellen Behandlung bei der Implantation und der fetalen Entwicklung in einem konsistenten Menschen testenner.

Murine Präimplantationsembryonen auf einen weiblichen Empfänger entweder in den Eileiter über den Ampullen von 0,5 Tage nach coitum (DPC) pseudo-Empfänger (Eileiter-Transfer) oder ^3,4 in die Gebärmutter von 2,5 dpc schein Empfänger (Gebärmutter-Transfer) ^5,6 übertragen werden je nach Entwicklungsstadium. Embryonen im Blastozystenstadium, wie sie verwendet werden, um chimäre Mäuse zu erzeugen, durch Injektion von embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen, sind in der Regel durch die Uterus Übertragung übertragen. Blastozysten können auch in den Eileiter einer 0,5 dpc Empfänger übertragen werden, aber es stellt eine weniger physiologischen Test für Entwicklungs Disruptoren, weil der Embryo durchläuft Diapause und hat 2 Tage, um von der Beleidigung zu erholen, bevor die Implantation stattfindet. Gebärmutter Übertragung beinhaltet Stechen der Uteruswand mit einem schmalen Nadel, um eine Öffnung, die den Zugang eines Embryo-Pipette in das Uteruslumen ermöglicht erzeugen. Abwohl diese Technik gute Ergebnisse (dh der Anteil der übertragenen Embryonen, die zu einem Welpen entwickeln) ist das Überleben zu Begriff oft niedrig und unberechenbar ^7,8.

Die Punktion der Uteruswand bringt einige nachteilige Nebenwirkungen. Erstens ist Myometrium ein stark vaskularisierten Gewebes und seine Punktion führt oft zu einer geringen Blutung. Blut kann die Embryotransfer Pipette blockieren oder dringen in die Uteruslumen verursacht embryonalen Tod und / oder Implantation Versagen. Dies ist besonders relevant, wenn Embryonen ohne zona übertragen werden, da die Blutzellen und Ablagerungen können zu den Blastomeren befestigen. Zweitens ist die Öffnung nicht verschließen durchgeführt, nachdem die Embryonen übertragen wurden, so dass sie durch die Öffnung fließen kann und zurück in die Bauchhöhle ausgestoßen wird, wenn ein zu großes Volumen hat, in den Uterus eingeführt worden ist. Die beschriebene utero-Eileiter-Embryo-Transfer hier die Vorteile der utero-Eileiter-Kreuzung, um die embr liefernYos in den Uterus ohne die Notwendigkeit der Punktion der Uteruswand und damit die Vermeidung ihrer nachteiligen Folgen ^9.

Die pseudo-Empfänger für Frauen Embryotransfer verwendet werden, durch natürliche Paarung mit Männchen vasektomierten ⁸ erhalten. Die Samensekret durch eine sterile Männchen produziert werden für die Gebärmutter erforderlich empfänglich für die Embryonen übertragen zu werden. Um einen Empfänger zu erhalten, werden maximal 2 Weibchen von 8 Wochen bis 6 Monaten mit einem männlichen vasektomierten in den Nachmittag gelegt. Am nächsten Morgen sind Frauen für das Vorhandensein einer vaginalen Kopulation Stecker, einem Klumpen geronnenen Proteinen aus der männlichen Samenflüssigkeit überprüft. Als während der Mitternachts Paarung erfolgt in der Regel, wird der Tag der vaginalen Plug-Erkennung als 0,5 dpc sein. Obwohl vasektomierten Männer können von einigen Händlern erworben werden kann, ist die hier beschriebene chirurgische Verfahren relativ einfach und erfordert keine zusätzliche Instrumente als für Embryotransfer erforderlich.

Protocol

Alle Tierversuche wurden von der Beltsville Bereich Animal Care und Verwenden Gremien (BAACUC 11-015) in Übereinstimmung mit USDA Animal Care und Verwenden Richtlinien genehmigt. 1. Anästhesie und Analgesie (gemeinsam für beide Chirurgische Verfahren) Wiegen Sie die Maus, und laden Sie die folgenden Anästhetika und analgetische in zwei 1 ml Spritzen mit 27 G Nadeln: Ketamin (0,1 mg / g: 0,01 ml / g einer 10 mg / ml) und Xylazin (0,01 …

Representative Results

Utero-Eileiter-Embryo-Transfer bietet eine mittlere Embryonen in die Gebärmutter vermeiden einige der Komplikationen an der Gebärmutterembryotransfer 2,9,10 verbunden zu übertragen. In Tabelle 1 zeigen wir einige repräsentative Ergebnis, das wir erhalten haben, die Übertragung CD1 Blastozysten, verschiedene Arten von Manipulationen CD1 Empfänger unterzogen nach dem beschriebenen Protokoll. Das Überleben zu Begriff (% der Embryonen, was zu einer Welpe) oder das Überleben bis E15 (im Fa…

Discussion

Die Vasektomie ist eine relativ einfach Operationstechnik, die keine großen Schwierigkeiten verbunden ist. Wenn Desinfektion mit Povidon-Jod und Ethanol stellen Sie sicher, dass der letzte Waschanlage (mit Ethanol) entfernt Povidoniod, da es das Bauchfell reizen. Der Zugang zu Samenleiter kann auch durch den Hodensack oder Durchführen einer transversalen Schnitt in den Bauch ⁸ erreicht werden. Scrotal Einschnitt wurde empfohlen, Bauchschnitt durch den vergleichsweise kleineren Schnitt benötigt und…

Materials

Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Micro dissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8.
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used, they made narrower drops.