Trasferimento di Embrione utero-tubarica e vasectomia nel modello murino
Summary
Utero-tubarico trasferimento di embrioni utilizza la giunzione utero-tubarica come barriera per impedire la fuoriuscita embrione che si può verificare quando si esegue il trasferimento uterino. Maschi vasectomized sono tenuti ad ottenere destinatari pseudopregnant per il trasferimento di embrioni. Entrambe le tecniche sono discusse.
Abstract
Il trasferimento di embrioni preimpianto ad una femmina surrogata è un passo necessario per la produzione di topi geneticamente modificati o per studiare gli effetti delle alterazioni epigenetiche originati durante lo sviluppo preimpianto sul successivo sviluppo ed adulto salute del feto. L'uso di una tecnica di trasferimento di embrioni efficace e coerente è fondamentale per migliorare la generazione di animali geneticamente modificati e per determinare l'effetto di trattamenti diversi su tassi di impianto e sopravvivenza a termine. Embrioni allo stadio di blastocisti vengono generalmente trasmesse mediante trasferimento uterino, eseguendo una puntura nella parete uterina introdurre la pipetta manipolazione embrione. L'orifizio eseguita in utero non viene chiuso dopo la pipetta è stata ritirata, e gli embrioni possono deflusso alla cavità addominale causa della pressione positiva dell'utero. La puntura può anche produrre una emorragia che altera l'impianto, blocca la pipetta di trasferimento e può influenzare embrione dviluppo, soprattutto quando gli embrioni che non vengono trasferiti zona. Di conseguenza, questa tecnica spesso si traduce in tassi di sopravvivenza partire embrione molto variabili e globali. Evitare questi effetti negativi, utero-tubarica trasferimento di embrioni approfittare della giunzione utero-tubarica come una barriera naturale che impedisce all'embrione di deflusso ed evitare la puntura della parete uterina. Maschi vasectomized sono necessari per ottenere i destinatari pseudopregnant. Una tecnica per eseguire vasectomia è descritto come un complemento al trasferimento di embrioni in utero-tubarica.
Introduction
Il trasferimento embrionale è probabilmente la procedura chirurgica più frequente eseguita nel modello murino. Questa tecnica è essenziale per ottenere discendenza di embrioni sottoposti a tecniche di manipolazione in vitro e, di conseguenza, costituisce un passo necessario per lo sviluppo di modelli geneticamente modificati mediante iniezione pronucleo, trasduzione lentivirale, o formazione di chimera. Inoltre, la tecnica consente di studiare gli effetti dello sviluppo di diverse insulti che si verificano durante lo sviluppo preimpianto. L'uso di tecniche di riproduzione artificiale 1 o l'esposizione a concentrazioni anomale di sostanze o metaboliti 2 diversi possono influenzare lo sviluppo embrionale con conseguente impianto o placentation guasti e gli effetti a lungo termine nella prole. Una tecnica di trasferimento di embrioni affidabile e riproducibile è fondamentale per verificare i possibili effetti negativi del trattamento sperimentale per l'impianto e lo sviluppo del feto in un uomo coerenteNER.
Embrioni murini preimpianto possono essere trasferiti ad una femmina destinatario sia in ovidotto tramite le ampolle di 0,5 giorni dopo coitum (DPC) destinatari pseudopregnant (trasferimento oviduct) 3,4 o nell'utero di 2,5 DPC destinatario pseudopregnant (trasferimento uterina) 5,6 a seconda del loro stadio di sviluppo. Embrioni allo stadio di blastocisti, come quelli utilizzati per generare topi chimerici mediante iniezione di cellule staminali pluripotenti embrionali o indotte, vengono di solito trasferite mediante trasferimento uterino. Blastocisti possono anche essere trasferiti a nell'ovidotto di un DPC destinatario 0.5, ma costituisce una prova meno fisiologica per disgregatori di sviluppo, perché l'embrione subisce diapausa e ha 2 giorni per recuperare dalla insulto prima dell'impianto avviene. Trasferimento uterino comporta perforando la parete uterina con un ago stretta in modo da generare una apertura che consente l'accesso di un embrione manipolazione pipetta nelle cavità uterina. Lanche se questa tecnica può produrre buoni risultati, la sopravvivenza a termine (ossia la percentuale di embrioni trasferiti che si sviluppano ad un cucciolo) è spesso bassa e imprevedibile 7,8.
La puntura della parete uterina comporta alcuni effetti collaterali dannosi. Primo, miometrio è un tessuto altamente vascolarizzato e la sua puntura provoca spesso una piccola emorragia. Il sangue può bloccare la pipetta di trasferimento dell'embrione o invadere il lume uterino causando la morte embrionale e / o guasto dell'impianto. Ciò è particolarmente rilevante quando gli embrioni senza zona vengono trasferiti, come le cellule del sangue e detriti possono allegare i blastomeri. In secondo luogo, l'apertura eseguita non sigilla dopo che gli embrioni sono stati trasferiti, in modo che può rifluire attraverso l'orifizio ed essere espulso alla cavità addominale quando un eccessivo volume è stato introdurre nell'utero. Il trasferimento di embrioni in utero-tubarica qui descritto approfittare della giunzione utero-tubarica per consegnare il embryos nell'utero senza la necessità di bucare la parete uterina e quindi evitando le conseguenze negative 9.
Le femmine destinatario pseudopregnant utilizzati per il trasferimento degli embrioni sono ottenuti per accoppiamento naturale con i maschi vasectomized 8. Le secrezioni seminali prodotti da un maschio sterile sono necessari per l'utero di diventare ricettivo agli embrioni trasferiti. Per ottenere un destinatario, un massimo di 2 femmine di otto settimane a 6 mesi di età sono posti con un maschio vasectomizzato nel pomeriggio. La mattina seguente, le femmine vengono controllati per la presenza di una spina copula vaginale, un ciuffo di proteine coagulate dal liquido seminale maschile. Come accoppiamento avviene di solito durante la mezzanotte, il giorno di rilevazione spina vaginale è considerato 0.5 dpc. Anche se i maschi vasectomized possono essere acquistati presso alcuni fornitori, la procedura chirurgica qui descritta è relativamente facile e non richiede strumenti aggiuntivi di quanto richiesto per il trasferimento degli embrioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
La vasectomia è una tecnica chirurgica in avanti relativamente semplice che non comporta grandi difficoltà. Quando sanificazione con povidone iodio ed etanolo assicurarsi che l'ultimo lavaggio (con etanolo) rimuove povidone iodio, in quanto può irritare il peritoneo. L'accesso al dotto deferente può essere ottenuta anche scroto o eseguendo una incisione trasversale nell'addome 8. Incisione scrotale è stato raccomandato di trasversali incisione addominale dovuto alla incisione relativ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del Dipartimento di Scienze Animali e aviaria a BT.
Materials
| Ketamine | VEDCO | Ketaved ANADA 200-257 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Xylazine | Lloyd laboratories | Anased NADA #139-236 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buprenorphine | Generic | NDC 400-42-010-01 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Eye ointment | Novartis | Genteal | |
| Antibiotic | Pfizer | Clavamox NADA #55-101. | Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water. |
| Dressing serrated forceps | ROBOZ | RS-8120 | Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work. |
| Micro dissecting serrated forceps | ROBOZ | RS-5137 | These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred. |
| Slight curved micro dissection forceps | ROBOZ | RS-5136 | This model is particularly useful to hold the oviduct. |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| 27G needles | Beckton-Dickinson | 305136 | Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big. |
| Clip applier | MiKRon | 42763 | |
| 9 mm Clips | MiKRon | 427631 | |
| Clip remover | MiKRon | 7637 | Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead. |
| Suture needle holder | ROBOZ | RS-7820 | |
| Suture | Dowist Gell | 5-0 Dexon S 7204-21 | Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle. |
| Glass capillaries | VWR | 100 ul calibrated pipettes 53432-921 | It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8. |
| Burner | KISAG AG | Typ 2002 | Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame. |
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. |
| Fiber optics ilumination | Dolan Jenner | Fiber lite | To iluminate the surgical area. There are different systems available. |
| Warm stages | American scope | http://store.amscope.com/tcs-100.html | These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked. |
| Culture dishes for embryo manipulation | Falcon | 353001 | 351008 may be also used, they made narrower drops. |
Referências
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