Utero-tubal Embryo Transfer og vasectomy i Mouse Model

Summary

Utero-tubal embryo bruker utero-tubal krysset som en barriere for å hindre at embryo utgang som kan oppstå når du utfører livmor overføring. Vasectomized menn er pålagt å skaffe pseudopregnant mottakere for embryo. Begge teknikker blir diskutert.

Abstract

Overføringen av preimplantation embryo til en surrogat Hunnen er et nødvendig steg for produksjon av genmodifiserte mus eller for å studere effektene av epigenetiske forandringer oppsto under preimplantation utvikling på påfølgende fosterutvikling og helse i voksen alder. Bruken av en effektiv og konsistent embryo-overføring er avgjørende for å forbedre genereringen av genetisk modifiserte dyr, og for å bestemme effekten av forskjellige behandlinger på implantasjon rater og overlevelse til termin. Embryoer ved blastocyst stadiet er vanligvis overføres ved livmor overføring, utføre en punktering i livmorveggen for å innføre embryo manipulasjon pipette. Den åpning utført i livmoren ikke lukkes etter at pipetten er trukket tilbake, og embryoene kan for utstrømning til bukhulen på grunn av det positive trykket i livmoren. Punktering kan også produsere en blødning som svekker implantasjon, blokkerer overføring pipette og kan påvirke fosteret development, spesielt når embryo uten zona overføres. Derfor denne teknikken resulterer ofte i svært variable og totale lav embryo overlevelse. Unngå disse negative effektene, utero-tubal embryo dra nytte av utero-tubal krysset som en naturlig barriere som hindrer embryo strøm og unngå punktering av livmorveggen. Vasectomized hanner er nødvendig for å skaffe pseudopregnant mottakere. En teknikk for å utføre vasektomi er beskrevet som et supplement til utero-tubal embryo.

Introduction

Embryo er sannsynligvis den hyppigste kirurgiske inngrepet utført i mus modell. Denne teknikken er svært viktig for å oppnå avkom fra embryoer som er utsatt for in vitro-manipulasjonsteknikker, og derfor utgjør et nødvendig trinn for utvikling av genetisk modifiserte modeller ved pronuclear injeksjon, lentiviral transduksjon eller chimera formasjonen. Dessuten lar teknikken studiet av de utviklingsmessige effekter av ulike fornærmelser oppstår under preimplantation utvikling. Bruken av kunstig befruktning ^pt eller eksponering for unormale konsentrasjoner av ulike stoffer eller metabolitter ^{2 mai} påvirke embryo utvikling som resulterer i implantasjon eller placentation feil og langsiktige effekter i avkommet. En pålitelig og reproduserbar embryo teknikk er avgjørende for å teste de mulige negative effekter av eksperimentell behandling på implantasjon og fosterutvikling i en konsekvent mannner.

Murine preimplantation embryoer kan overføres til en mottaker kvinnelige enten inn i oviduct via ampullae av 0,5 dager etter coitum (DPS) pseudopregnant mottakere (oviduct overføre) ^3,4 eller inn i livmoren av 2,5 DPC pseudopregnant mottaker (livmor transfer) ^5,6 avhengig av deres utviklingsstadiet. Embryoer ved blastocyststadiet, slik som de som brukes til å generere kimære mus ved injeksjon av embryonale eller indusert pluripotente stamceller, blir vanligvis overført ved uterin overføring. Blastocysts kan også bli overført til egglederen av en 0,5 DPC mottakeren, men det utgjør en mindre fysiologisk test for utviklingsforstyrrende, fordi fosteret gjennomgår diapause og har to dager å komme seg fra den fornærmelse før implantasjon foregår. Uterin overføring omfatter punktering av livmorveggen med en smal nål for å generere en åpning som tillater adgang til et embryo manipulasjon pipette inn i de uterine hulrommet. Aelv om denne teknikken kan gi gode resultater, (dvs. andelen overførte embryoer som utvikler seg til en valp) er overlevelsen til begrepet ofte lav og uforutsigbar ^7,8.

Punktering av livmorveggen innebærer noen skadelige bivirkninger. For det første er myometrium et sterkt vaskularisert vev og dets punktering resulterer ofte i en lite blødning. Blod kan blokkere embryo pipette eller invadere livmor lumen forårsaker embryonale død og / eller implantasjon svikt. Dette er spesielt relevant når embryo uten zona overføres, som blodceller og rusk kan feste til blastomeres. For det andre, tillater åpningen utføres ikke segl etter at embryoene er blitt overført, slik at de kan strømme tilbake gjennom åpningen og bli utvist til bukhulen når et for stort volum er introdusere inn i livmoren. Den utero-tubal embryo beskrevet her dra nytte av utero-tubal veikryss å levere embryos inn i livmoren uten behov for punktering av livmorveggen, og derved unngå de uheldige konsekvenser ^9.

De pseudopregnant mottaker hunner som brukes for embryo oppnås ved naturlig paring med vasectomized hanner ^åtte. Den banebrytende sekret som produseres av en steril mann er nødvendig for livmoren å bli mottakelig for de overførte embryoer. For å få en mottaker, er maksimalt to hunner av åtte uker til seks måneders alder plassert med en vasectomized mann i ettermiddag. Den følgende morgen, blir hunn kontrolleres for tilstedeværelsen av en vaginal copulation plugg, en klump av koagulerte proteiner fra den mannlige seminal væske. Som parring forekommer vanligvis i løpet midnatt, er dagen for vaginal plug deteksjon anses å være 0,5 DPC. Selv vasectomized hanner kan kjøpes fra noen leverandører, er den kirurgiske prosedyren beskrevet her forholdsvis enkel, og krever ikke noen ekstra instrumenter enn det som kreves for embryo.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av Beltsville området Animal Care og bruk komiteer (BAACUC 11-015) i samsvar med USDA Animal Care og bruk retningslinjene. En. Anestesi og analgesi (felles for begge kirurgiske prosedyrer) Vei musen og laste inn følgende anestesi og smertestillende i to 1 ml sprøyter med 27 G kanyler: Ketamin (0,1 mg / g: 0,01 ml / g av en 10 mg / ml oppløsning) og xylazin (0,01 mg / g: 0,005 ml / g av en 2 mg / ml løsni…

Representative Results

Utero-tubal embryo gir et middel for å overføre embryo i livmoren unngå noen av komplikasjoner knyttet til livmor embryo 2,9,10. I tabell 1 viser vi noen representativt resultat vi har oppnådd overføre CD1 blastocysts utsatt for ulike typer manipulasjoner til CD1 mottakere følge protokollen beskrevet. Overlevelsen til sikt (% av embryoer som resulterer i en pup) eller overlevelsen til E15 (i tilfelle av lentivirus eksponert) er lik for embryoer bare dyrket in vitro fra zygote t…

Discussion

Vasektomi er en relativt rett frem kirurgisk teknikk som ikke involverer store vanskeligheter. Når desinfiserende med povidonjodid og etanol sørge for at siste vask (med etanol) fjerner povidonjodid, da det kan irritere bukhinnen. Tilgangen til vas deferens kan også oppnås ved pungen eller utfører en tverrgående snitt i buken ^8.. Scrotal snitt har blitt anbefalt å avkuttingssk jær abdominal snitt på grunn av den relativt mindre snitt trengte og litt bedre postoperativ atferd ^11. M…

Materials

Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Micro dissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8.
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used, they made narrower drops.