Utéro-tubaire transfert d'embryons et la vasectomie dans le modèle de souris

Summary

Le transfert d'embryons utéro-tubaire utilise la jonction utéro-tubaire comme une barrière pour empêcher l'écoulement de l'embryon qui peut se produire lors de l'exécution de transfert de l'utérus. Les hommes ayant subi une vasectomie sont nécessaires pour obtenir bénéficiaires pseudo-pour le transfert d'embryon. Ces deux techniques sont discutées.

Abstract

Le transfert d'embryons de pré-implantation à une femme de substitution est une étape nécessaire à la production de souris génétiquement modifiées ou pour étudier les effets de modifications épigénétiques origine au cours du développement préimplantatoire sur le développement et la santé du fœtus adulte ultérieure. L'utilisation d'une technique de transfert d'embryons efficace et uniforme est essentielle pour améliorer la production d'animaux génétiquement modifiés, et à déterminer l'effet de différents traitements sur les taux d'implantation et de survie à long terme. Des embryons au stade de blastocyste sont généralement transférés par transfert de l'utérus, la réalisation d'une ponction dans la paroi utérine pour introduire la pipette de la manipulation de l'embryon. L'orifice effectué dans l'utérus ne se ferme pas après la pipette est retirée, et les embryons peuvent écoulement à la cavité abdominale, en raison de la pression positive de l'utérus. La ponction peut également produire une hémorragie qui affecte l'implantation, bloque la pipette de transfert et peut affecter l'embryon développement, en particulier lorsque les embryons sont transférés sans zona. Par conséquent, cette technique entraîne souvent des taux de survie faible embryon très variables et globaux. Éviter ces effets négatifs, le transfert d'embryon utéro-tubaire profiter de la jonction utéro-tubaire comme une barrière naturelle qui empêche l'embryon sorties et éviter la ponction de la paroi utérine. Les hommes ayant subi une vasectomie sont nécessaires pour obtenir bénéficiaires pseudo-. Une technique pour effectuer la vasectomie est décrite en tant que complément au transfert d'embryons utéro-tubaire.

Introduction

Le transfert d'embryons est probablement l'intervention chirurgicale le plus souvent réalisée dans le modèle de souris. Cette technique est essentielle pour obtenir la progéniture d'embryons in vitro soumis à des techniques de manipulation dans et, par conséquent, constitue une étape nécessaire pour le développement de modèles génétiquement modifiés par injection pronucléaire, transduction lentivirus, ou la formation de chimère. En outre, la technique permet l'étude des effets sur le développement de diverses insultes qui se produisent au cours du développement préimplantatoire. L'utilisation des techniques de reproduction artificielle ¹ ou l'exposition à des concentrations anormales de différentes substances ou métabolites ^{2 mai} affecter le développement de l'embryon, entraînant des échecs d'implantation ou placentation et les effets à long terme sur la progéniture. Une technique de transfert d'embryons fiable et reproductible est cruciale pour tester les effets négatifs possibles du traitement expérimental sur l'implantation et le développement du fœtus chez un homme cohérentner.

Embryons préimplantatoires murins peuvent être transférés à un destinataire femelle soit dans l'oviducte par les ampoules de 0,5 jours après le coït (DPC) des destinataires pseudo-(transfert de l'oviducte) ^3,4 ou dans l'utérus de 2,5 dpc destinataire pseudogestante (transfert de l'utérus) ^5,6 en fonction de leur stade de développement. Des embryons au stade de blastocyste, tels que ceux qui sont utilisés pour générer des souris chimères par injection de cellules souches embryonnaires pluripotentes ou induites, sont généralement transférés par transfert de l'utérus. Blastocystes peuvent aussi être transférées à l'oviducte d'une DPC bénéficiaire de 0,5, mais il constitue un test moins physiologique pour les perturbateurs de développement, parce que l'embryon subit diapause et dispose de 2 jours pour récupérer de l'insulte avant l'implantation a lieu. transfert de l'utérus implique la perforation de la paroi de l'utérus avec une aiguille étroit afin de générer une ouverture qui permet l'accès d'une pipette manipulation de l'embryon dans la lumière utérine. Aien que cette technique peut donner de bons résultats, la survie à long terme (à savoir le pourcentage d'embryons transférés qui se développent à un chiot) est souvent faible et imprévisible ^7,8.

La perforation de la paroi utérine entraîne des effets secondaires néfastes. Tout d'abord, le myomètre est un tissu très vascularisé et sa perforation en résulte souvent une petite hémorragie. Le sang peut bloquer la pipette de transfert d'embryons ou d'envahir la lumière utérine causant la mort de l'embryon et / ou de l'échec de l'implantation. Ceci est particulièrement pertinent lorsque les embryons sont transférés sans zona, comme les cellules sanguines et les débris peuvent joindre les blastomères. Deuxièmement, l'ouverture réalisée n'est pas étanche après les embryons ont été transférés, de sorte qu'ils peuvent circuler à travers l'orifice et être expulsé de la cavité abdominale quand un trop grand volume a été d'introduire dans l'utérus. Le transfert de l'embryon in utero-tubaire décrit ici profiter de la jonction utéro-tubaire de livrer le embryo dans l'utérus sans avoir besoin de perforer la paroi utérine et ainsi éviter ses conséquences néfastes ^9.

Les femmes bénéficiaires de pseudo-utilisés pour le transfert d'embryons sont obtenus par accouplement naturel avec des hommes ayant subi une vasectomie ^8. Les sécrétions séminales produites par un mâle stérile sont nécessaires pour l'utérus à devenir réceptive aux embryons transférés. Pour obtenir un destinataire, un maximum de 2 femelles de 8 semaines à 6 mois d'âge sont placés avec un mâle vasectomisé dans l'après-midi. Le lendemain matin, les femmes sont vérifiés pour la présence d'un bouchon de copulation vaginale, un bouquet de protéines coagulées du liquide séminal masculin. Comme l'accouplement a lieu habituellement pendant minuit, le jour de la détection de bouchon vaginal est considéré comme 0,5 dpc. Bien que les mâles vasectomisés peuvent être achetés auprès de certains fournisseurs, la procédure chirurgicale décrite ici est relativement facile et ne nécessite pas d'instruments supplémentaires que nécessaire pour le transfert d'embryons.

Protocol

Toutes les expériences animales ont été approuvés par la Région Beltsville soin et l'utilisation des animaux Comités (BAACUC 11-015) en conformité avec l'USDA Animal Care et Directives d'utilisation. Une. Anesthésie et l'analgésie (commune pour les deux interventions chirurgicales) Peser la souris et charger les anesthésiques et analgésiques suivants dans deux seringues de 1 ml avec 27 g d'aiguilles: La két…

Representative Results

Transfert d'embryons utéro-tubaire fournit un moyen de transférer les embryons dans l'utérus d'éviter certaines des complications associées au transfert d'embryon de l'utérus 2,9,10. Dans le tableau 1, nous montrons un résultat représentatif, nous avons obtenu le transfert de blastocystes CD1 soumis à différents types de manipulations aux bénéficiaires CD1 suivant le protocole décrit. La survie à long terme (% des embryons résultant en un chiot) ou la survie…

Discussion

La vasectomie est une technique chirurgicale relativement simple qui ne comporte pas de difficultés majeures. Quand la stérilisation avec de la povidone iode et de l'éthanol assurez-vous que le dernier lavage (avec de l'éthanol) supprime povidone iode, car il peut irriter le péritoine. L'accès au canal déférent peut également être obtenue par le scrotum ou la réalisation d'une incision transversale dans l'abdomen ^8. Incision scrotale a été recommandé de transversales…

Materials

Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Micro dissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8.
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used, they made narrower drops.