Dieser Bericht beschreibt eine einfache und schnelle Technik der intrathekalen Punktion für eine lokalisierte Transfektion von siRNA in der Lenden-Wirbelsäule in der Maus unter Kurznarkose dauerhafte Licht.
Dieser Bericht beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Technik der akuten intrathekalen Nadel-Injektionen in einer nicht-invasive Weise, dh unabhängig von der Katheter-Implantation. Der technische Nachteil dieser Operationstechnik liegt in der Feinheit der Hände. Die Einspritzung schnell, vor allem für einen geschulten Experimentator, und da Gewebezerstörung mit dieser Technik minimal ist, sind wiederholte Injektionen möglich, außerdem Immunreaktion auf Fremdwerkzeugen (. Z. B. Katheter) tritt nicht auf, wodurch eine bessere und spezifischere ausgelesen Rückenmarks Modulation. Da die Anwendung der Substanz im Wesentlichen auf die Zielregion des Rückenmarks beschränkt sind, Arzneimittel, nicht in großen Dosierungen angewendet werden müssen, und vor allem unerwünschte Wirkungen auf andere Gewebe, wie bei einer systemischen Verabreichung beobachtet dann umgangen werden, 1, 2. Darüber hinaus kombinieren wir diese Technik mit in-vivo-Transfektion von Nukleinsäure mit Hilfe polyethylenimine (PEI)-Reagens 3, die enorme Vielseitigkeit für die Untersuchung der Wirbelsäule Funktionen über Lieferung von pharmakologischen Wirkstoffen sowie Gen-, RNA-und Protein-Modulatoren zur Verfügung stellt.
Das Rückenmark ist ein sehr wichtiges Zentrum in einer Vielzahl von wichtigen biologischen Prozessen und physiologischen Funktionen, einschließlich der Verarbeitung und Übertragung von schmerzhaften (nozizeptiven) Eingängen 4-7. Verschiedene experimentelle Techniken entwickelt, um pharmakologische Modulation des Rückenmarks, wie chronische Implantation intrathekalen Katheter 8, Rückenmark-Mikroinjektion und intrathekale Injektion Nadel 9 zu ermöglichen. Jedes Verfahren hat seine eigenen Vorteile und Nachteile, je nach dem Experiment Paradigma eine Technik vielleicht besser geeignet als die anderen. Während chronische Implantation von intrathekalen Katheter ist ohne weiteres möglich in Ratte, ist diese Methode sehr schwierig in der Maus, da Größenbeschränkungen. Erfolgsquote ist sehr niedrig und motorische Defizite auftreten, oft aufgrund der sperrigen Anwesenheit eines Katheters in der stark beschränkt Subduralraum in der Maus. Darüber hinaus wird langfristig Abgabe von Medikamenten durch häufige Gerinnungs gemachtchronisch implantierten Katheter. Schließlich sind Immunreaktionen häufig.
Diese Probleme können unter Verwendung des Verfahrens von akuten intrathekale Injektion durch eine Nadel in der Abwesenheit eines vorimplantiert Katheter, der einen schnellen und anatomisch begrenzte Anwendung von Medikamenten und Reagenzien zu dem Rückenmark von Mäusen können umgangen werden. Dieses Verfahren die Vorteile der intrathekale Abgabe über andere systemische Lieferwege (z. B. oral, intravenös, intraperitoneal, etc.), wie Spezifität Rücken Modulation, die Dosierungen verringert und Grenze Nebenwirkungen erlaubt, sowie die Fähigkeit zu liefern Stoffe nicht vollständig beibehält normalerweise nicht die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, da während intrathekale Injektion wird die Nadel zwischen der Dura und dem Rückenmark eingesetzt. Wichtig ist jedoch im Vergleich zu anderen Methoden der intrathekalen Lieferung, ist die intrathekale Nadelinjektion die am wenigsten invasive Verfahren, so dass eine Vielzahl von Anwendungen in derelbe Tier, ohne dass eine erhebliche Gewebeschädigung oder Immunreaktion hervorzurufen durch Implantation von Fremdmaterial. Technische Fähigkeiten erfordert jedoch eine sehr genaue Ausrichtung der Nadel, um die Wirksamkeit zu ermöglichen.
Hier haben wir visuell demonstrieren das Verfahren zum Erreichen einer optimalen Erfolgsquote für die speziell auf die Lendenrückenmark. Die Injektionsstelle, die in diesem Experiment gewählt wird, ist die Nut zwischen L5 und L6 wirbel Spalte, in der Nähe, wo das Rückenmark endet, um die Möglichkeit der Beschädigung der Wirbelsäule zu minimieren. Darüber hinaus zeigen wir die Verwendung dieser Technik, um Gene im Rückenmark mit siRNAs niederschlagen.
Somit ist die oben beschriebene Technik der Nadel intrathekale Injektionen wirksam, schnell, spezifisch lokalisiert und zerstörungsfrei. Technisch gesehen ist der wichtigste Aspekt des Verfahrens der Punkt der Nadeleinführung in die Nut. Es ist entscheidend, dass dieses Verfahren mit einer sehr ruhigen Hand und Geduld getan. Wie viele chirurgische Verfahren, Schulung verbessert die Rate der erfolgreichen Injektion. Dies ist auch deshalb wichtig, weil bei einem tatsächlichen Experiment erfordert diese Technik keine of…
The authors have nothing to disclose.
in vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
Control siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
Anti-ß-Tubulin III antibody | Sigma | T2200 | |
Anti-WAVE1 antibody | R&D Systems | AF5514 | |
Fast green dye | Sigma | F-7252 | |
Isoflurane | Baxter | ||
Isoflurane setup | Dräger Lübeck | ||
Shaver | Wella | ||
Hamilton syringe Gastight 1702 | Hamilton | ||
30G 1/2, 0,3 * 13mm Needle | BD Microlance | 304000 | |
Microscope Leica MS5 | Leica | ||
WAVE1 forward primer for qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
WAVE1 reversed primer for qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |