In Vivo siRNA transfektion og Gene Knockdown i Spinal Cord via Rapid Noninvasiv Lumbar Intrathekal Injektioner i mus
Summary
Denne rapport beskriver en enkel og hurtig teknik til intratekal nål punktering for en lokaliseret transfektion af siRNA i den lumbale rygmarv i mus under kortvarig let anæstesi.
Abstract
Denne rapport beskriver en trin-for-trin guide til teknikken af akutte intratekal nål injektioner på en noninvasiv måde, dvs uafhængigt af kateter implantation. Den tekniske begrænsning af denne kirurgiske teknik ligger i finesse af hænderne. Injektionen er hurtig, især for en uddannet eksperimentatoren, og siden vævsødelæggelse med denne teknik er minimal, er mulige gentagne injektioner og desuden immunreaktion udenlandske værktøj (. F.eks kateter) ikke forekommer, hvilket giver en bedre og mere specifik udlæses af rygmarven graduering. Da anvendelsen af stoffet i høj grad er begrænset til målområdet i rygmarven, kan lægemidler, der ikke skal anvendes i store doser, og endnu vigtigere uønskede virkninger på andre væv, som observeret en systemisk levering, kunne blive omgået 1, 2. Desuden har vi kombinere denne teknik med in vivo-transfektion af nukleinsyre ved hjælp af polyethylenimine (PEI) reagens 3, som giver enorme alsidighed til at studere spinal funktioner via levering af farmakologiske midler samt gen, RNA og protein-modulatorer.
Introduction
Rygmarven er en meget vigtigt centrum i en lang række vigtige biologiske processer og fysiologiske funktioner, herunder behandling og transmission af smertefulde (nociceptive) indgange 4-7. Forskellige eksperimentelle teknikker er blevet udviklet for at lette farmakologisk modulation af rygmarv, såsom kronisk implantation af intratekale katetere 8, rygmarv mikroinjektion og intrathecal injektion med nål 9. Hver teknik har sine egne fordele og ulemper, og afhængig af eksperimentet paradigme en teknik kan være mere egnede end de andre. Betragtninger kronisk implantation af intratekal katetre er let gennemførlig i rotter, er meget vanskeligt denne metode i mus, givet størrelse restriktioner. Succes er meget lav og motoriske underskud opstår ofte på grund af den omfangsrige tilstedeværelse af et kateter i den alvorligt begrænset subduralt plads i mus. Desuden er langsigtet afgivelse af lægemidler gengives på grund af hyppig størkningaf kronisk implanterede katetre. Endelig immunreaktioner er almindelige.
Disse problemer kan afhjælpes ved anvendelse af fremgangsmåden af akut intratekal injektion via en nål i fravær af en preimplanted kateter, som muliggør en hurtig og anatomisk begrænsede anvendelse af lægemidler og reagenser til rygmarven i mus. Denne metode bevarer fuldt ud fordelene ved intratekal levering via andre systemiske administrationsveje (fx oral, intravenøs, intraperitoneal osv.), såsom specificiteten af spinal modulation, der tillader reducerede doseringer og begrænse bivirkninger, såvel som evnen til at levere stoffer ikke normalt ikke krydse blod-hjerne barrieren, da løbet intratekal injektion, indsættes nålen mellem dura mater og rygmarven. Vigtigere men i forhold til andre metoder til intratekal levering, intratekal nåleinjektion metode er den mindst invasive, så talrige anvendelser isamme dyr uden at forårsage nogen betydelig vævsskade eller fremkalder immunreaktion grund implantation af fremmed materiale. Men det kræver tekniske færdigheder for en meget præcis målretning af nålen for at tillade effekt.
Her har vi visuelt demonstrere metode til at opnå en optimal hastighed på succes for specifikt rettet mod den lumbale rygmarv. Injektionsstedet der er valgt i dette eksperiment er rillen mellem L5 og L6 hvirveldyr kolonne, tæt på hvor rygmarven slutter, for at minimere risikoen for at beskadige rygsøjlen. Desuden vi demonstrere brugen af denne teknik til at vælte gener i rygmarven ved hjælp siRNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ovenfor beskrevne teknik intratekal nål injektioner er effektiv, hurtig, specielt lokaliseret og ikke-destruktiv. Teknisk set mest kritiske aspekt af denne procedure er det punkt af indføring af kanylen ind i rillen. Det er afgørende, at denne procedure er gjort med meget rolige hænder og tålmodighed. Ligesom mange kirurgiske procedurer, uddannelse forbedrer hastigheden af en vellykket injektion. Det er også vigtigt, fordi i et virkeligt eksperiment, er denne teknik ikke en indlysende indikator direkte be…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| in vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Control siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Anti-ß-Tubulin III antibody | Sigma | T2200 | |
| Anti-WAVE1 antibody | R&D Systems | AF5514 | |
| Fast green dye | Sigma | F-7252 | |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isoflurane setup | Dräger Lübeck | ||
| Shaver | Wella | ||
| Hamilton syringe Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30G 1/2, 0,3 * 13mm Needle | BD Microlance | 304000 | |
| Microscope Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 forward primer for qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 reversed primer for qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
Referências
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling. Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).
- Goula, D., et al. Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther. , 1291-1295 (1998).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).
- Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2. Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).
- Song, Z. H., Takemori, A. E. Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).
- Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance. Neurociência. , 1275-1288 (2007).
- Yaksh, T. L., Rudy, T. A. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. , 677-681 (2006).
- Bourinet, E., et al. Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception. EMBO J. 24, 315-324 (2005).
- Wang, X., et al. Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves. Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).
- Wigdor, S., Wilcox, G. L. Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).
