In Vivo transfection de siRNA et Gene Knockdown dans la moelle épinière via rapide non invasive lombaire intrathécale injections chez des souris
Summary
Ce rapport décrit une technique simple et rapide de intrathécale ponction à l'aiguille pour une transfection de siRNA localisée dans la moelle épinière lombaire chez la souris sous anesthésie de courte durée de lumière durable.
Abstract
Ce rapport décrit un guide étape par étape pour la technique des injections de seringues intrathécales aigus de manière non invasive, c'est à dire indépendant du cathéter implantation. La limitation de cette technique réside dans la technique chirurgicale de la finesse des aiguilles. L'injection est rapide, en particulier pour un expérimentateur formé, et étant donné que la perturbation de tissu avec cette technique est minime, des injections répétées sont possibles; réaction en outre à l'abri des outils étrangers (. Par exemple de cathéter) ne se produit pas, ce qui donne une meilleure et plus précise read out de modulation de la moelle épinière. Etant donné que l'application de la substance est largement limitée à la région cible de la moelle épinière, les médicaments n'ont pas besoin d'être appliqué à des doses importantes, et des effets plus important non désirés sur d'autres tissus, comme observé avec une administration systémique, peuvent être contournées 1, 2. Par ailleurs, on combine cette technique avec la transfection in vivo d'acides nucléiques à l'aide d'polyethylenimine (PEI) réactif 3, qui fournit grande polyvalence pour l'étude des fonctions de la colonne vertébrale par l'intermédiaire de l'administration d'agents pharmacologiques, ainsi que le gène, l'ARN, et des modulateurs de protéine.
Introduction
La moelle épinière est un centre très important dans une variété de processus biologiques clés et les fonctions physiologiques, y compris le traitement et la transmission des entrées douloureuses (nociceptives) 4-7. Diverses techniques expérimentales ont été développées pour faciliter la modulation pharmacologique de la moelle épinière, par exemple une implantation chronique de cathéter intrathécal 8, la moelle épinière de la micro-injection et l'injection intrathécale de l'aiguille 9. Chaque technique a ses avantages et ses inconvénients, et selon le paradigme d'une expérience technique pourrait être plus appropriés que les autres. Considérant que l'implantation chronique de cathéter intrathécal est facilement réalisable chez le rat, ce procédé est très difficile dans la souris, étant donné les restrictions de taille. Le taux de réussite est très faible et des déficits moteurs se produit souvent en raison de la présence encombrante d'un cathéter dans l'espace sous-dural sévèrement limitée dans la souris. Par ailleurs, la livraison à long terme de médicaments est rendu en raison de la coagulation fréquentesdes cathéters implantés de façon chronique. Enfin, les réactions immunitaires sont fréquentes.
Ces problèmes peuvent être contournés en utilisant le procédé de l'injection intrathécale aiguë par une aiguille en l'absence d'un cathéter preimplanted, ce qui permet une application rapide et anatomiquement limité de médicaments et de réactifs de la moelle épinière chez les souris. Cette méthode conserve tous les avantages de intrathécale sur d'autres voies d'administration systémiques (par exemple, orale, intraveineuse, intrapéritonéale, etc), tels que la spécificité de la modulation de la moelle, ce qui permet des doses réduites et les effets secondaires de fin de course, ainsi que la capacité à délivrer des substances ne normalement ne pas traverser la barrière hémato-encéphalique depuis lors de l'injection intrathécale, l'aiguille est insérée entre la dure-mère et la moelle épinière. Fait important, toutefois, par rapport à d'autres méthodes d'administration intrathécale, le procédé d'injection de l'aiguille par voie intrathécale est la moins invasive, ce qui permet de nombreuses applications dans l'même animal sans causer de dommages aux tissus considérable ou évoquant la réaction immunitaire en raison de l'implantation de matériel étranger. Cependant, il nécessite des compétences techniques pour un ciblage très précis de l'aiguille pour permettre l'efficacité.
Ici, nous démontrons visuellement la méthode pour atteindre un taux optimal de réussite pour cibler spécifiquement la moelle épinière lombaire. Le site d'injection qui est choisie dans cette expérience est de la rainure entre L5 et L6 colonne vertébré, à proximité de l'endroit où se termine la moelle épinière, de réduire au minimum le risque d'endommager la colonne vertébrale. En outre, nous démontrons l'utilisation de cette technique pour abattre des gènes dans la moelle épinière en utilisant des siRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ainsi, la technique décrite ci-dessus des injections intrathécales de seringues est efficace, rapide, précisément localisée, et non destructif. Techniquement, l'aspect le plus critique de cette procédure est le point d'insertion de l'aiguille dans la gorge. Il est essentiel que cette procédure se fait avec les mains et la patience très calme. Comme de nombreuses procédures chirurgicales, la formation améliore la vitesse d'injection réussie. Cela est également important, car lors d'une exp…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| in vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Control siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Anti-ß-Tubulin III antibody | Sigma | T2200 | |
| Anti-WAVE1 antibody | R&D Systems | AF5514 | |
| Fast green dye | Sigma | F-7252 | |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isoflurane setup | Dräger Lübeck | ||
| Shaver | Wella | ||
| Hamilton syringe Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30G 1/2, 0,3 * 13mm Needle | BD Microlance | 304000 | |
| Microscope Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 forward primer for qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 reversed primer for qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
Referências
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