Avaliando Clearance fagocítica de morte celular em Curso Experimental de Ligatable fluorescentes Sondas
Summary
Nós apresentamos uma nova técnica de fluorescência para seletiva marcação in situ de células fagocíticas ativos, o que claro off corpos celulares em acidente vascular cerebral. A abordagem é importante para a avaliação da reacção à isquemia cerebral uma vez que só uma pequena proporção de fagócitos presentes no cérebro isquémico participar na depuração de morte celular.
Abstract
Nós descrevemos uma nova abordagem histoquímica para visualização de folga fagocitária em isquemia cerebral focal. A abordagem permite o estudo da eliminação de células mortas no acidente vascular cerebral por fagócitos de qualquer linhagem celular de gestão de resíduos. Apesar de numerosas células de origens diferentes, que são capazes de fagocitose estão presentes no cérebro isquémico, apenas uma parte deles activamente engolir e digerir corpos celulares. A visualização seletiva, quantificação e análise de tais de gestão de resíduos fagocitária ativa são úteis na avaliação da resposta do cérebro à isquemia. Remoção eficiente morte celular é importante para a recuperação do cérebro de uma lesão isquêmica, uma vez que abre o caminho para os processos regenerativos subseqüentes. A falha para limpar os cadáveres que resultaria numa reacção tóxica causada por ADN não degradado e proteínas. O procedimento descrito utiliza sondas fluorescentes ligados seletivamente por uma topoisomerase viral para quebras de DNA característicos produzidos em todos os fagócitos durante imersãoe digestão das células irreversivelmente danificadas por isquemia. O método é uma nova ferramenta para a investigação da reação cerebral à isquemia.
Introduction
Acidente vascular cerebral isquêmico induz mudanças profundas no tecido cerebral afetada. Ela inicia a morte celular em massa, o que leva à rápida activação das células fagocíticas residentes de origem da microglia. É também desencadeia a infiltração de cérebro isquémico por vários tipos de fagócitos profissionais derivadas do sangue, incluindo neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e células mastro 1,2.
Ainda está em discussão se esta resposta à lesão isquêmica desempenha um papel positivo ou negativo. Embora a fagocitose após o AVC pode ser benéfico porque ele limpa as células mortas e suprime a inflamação, ele também gera espécies reativas de oxigênio tóxicos que afetam a sobrevivência neuronal e exacerbando o dano tecidual 1-5.
Embora vários tipos de células fagocíticas infiltrar cerebral isquêmico, nem todos eles participar na gestão de resíduos por engolindo corpos celulares e abrindo caminho para processos regenerativos 1-3. Esta creates um requisito para identificação seletiva de células de gestão de resíduos que realizam folga fagocitária de morte celular em acidente vascular cerebral. Quando imaginando essas células de gestão de resíduos em atividade, também é importante para responder à questão de como eficientemente eles degradam os corpos celulares engoliram. A degradação efetiva e completa do DNA da célula morrer na fagocitose é essencial, pois evita a auto-imunização e a liberação de material nuclear patológica 6.
Aqui apresentamos novas sondas que usam quebras específicas de DNA como marcadores de células fagocíticas ativas. Estas pausas assinatura são produzidos exclusivamente durante quebra de núcleos tragado dentro das células de gestão de resíduos funcionais. Por conseguinte, as sondas de etiquetar selectivamente apenas os fagócitos que engolir e digerir activamente corpos celulares. Eles também permitem observar a intensidade e a conclusão de repartição de ADN após a imersão. As sondas são úteis na avaliação de intensidade e efficirência de folga fagocitária.
As novas sondas de contar com um marcador não baseadas em proteína e, portanto, pode ser particularmente vantajoso em estudos de acidente vascular cerebral, em que grande dano isquémico pode perturbar a morfologia celular ou empobrecem marcadores à base de proteínas, especialmente no interior da zona do núcleo isquémico.
O princípio da técnica é apresentada na Figura 1. A figura mostra as sondas oligonucleotídicas em forma de grampo ligados pela topoisomerase vaccinia enzima (VACC TOPO) de ADN 5'OH termina gerado por lisossomal DNase II durante a digestão do ADN 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste vídeo podemos demonstrar, no formato de secção de tecido, como rotular fagócitos ativos que a morte de células claras em isquemia cerebral focal. A técnica apresentada é a primeira abordagem que rotula especificamente apenas as células de gestão de resíduos que engoliram e digerem ativamente corpos celulares. Isto faz com que seja vantajosa em relação a outros métodos existentes para a marcação das células fagocíticas, que não têm essa capacidade.
O método utiliza u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pela concessão R01NS062842 do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame, Institutos Nacionais de Saúde (VVD) e por doações R21 NS064403 do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame, Institutos Nacionais de Saúde, através ARRA (VVD) e R21 EB006301 Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia, National Institutes of Health (VVD).
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μL stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’ ; B – Biotin-dT; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μL stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Equipment | |||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph | ||
Referências
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- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
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