Summary
Vi præsenterer en ny fluorescens teknik til selektiv in situ mærkning af aktive fagocytceller, som klare off celle lig i slagtilfælde. Den fremgangsmåde er vigtig for vurderingen hjernens reaktion på iskæmi, fordi kun en lille del af fagocytter stede i iskæmisk hjerne deltage i clearance af celledød.
Abstract
Vi beskriver en ny histokemisk metode til visualisering af fagocytisk clearance i fokal hjerne iskæmi. Den tilgang tillader studiet af eliminering af døde celler i slagtilfælde ved affaldshåndtering fagocytter af enhver cellulær afstamning. Selvom mange celler af forskellig oprindelse, der er i stand til fagocytose er til stede i iskæmisk hjerne, kun en del af dem opsluge aktivt og fordøje celle lig. Den selektive visualisering, kvantificering og analyse af en sådan aktiv affaldshåndtering fagocytær er nyttige i forbindelse med vurderingen hjernens reaktion på iskæmi. Effektiv celledød clearance er vigtig for hjernens opsving fra iskæmisk skade, da det åbner vejen for de efterfølgende regenerative processer. Den manglende evne til at rense lig ville resultere i en toksisk reaktion forårsaget af ikke-nedbrudt DNA og proteiner. Den beskrevne fremgangsmåde anvender fluorescerende prober selektivt ligeret med en viral topoisomerase til karakteristiske DNA-brud produceret i alle fagocytter under engulfmentog fordøjelse af celler irreversibelt beskadiget af iskæmi. Metoden er et nyt værktøj til undersøgelse af hjernens reaktion på iskæmisk skade.
Introduction
Iskæmisk slagtilfælde inducerer dybtgående ændringer i de berørte hjernevæv. Den indleder massiv celledød, hvilket fører til en hurtig aktivering af hjemmehørende fagocytceller af microglial oprindelse. Det sætter også off infiltration af iskæmisk hjerne ved forskellige former for blodafledte professionelle fagocytter, herunder neutrofiler, makrofager, dendritiske og mastceller 1,2.
Det er stadig diskuteres, hvorvidt dette svar iskæmisk skade spiller en positiv eller negativ rolle. Selvom fagocytose efter slagtilfælde kan være gavnligt, fordi det rydder døde celler og undertrykker inflammation, det skaber også giftige reaktive ilt arter påvirker neuronal overlevelse og forværrer vævsskader 1-5.
Mens flere typer af fagocytceller infiltrere iskæmisk hjerne, ikke alle af dem deltager i affaldshåndtering ved at opsluge celle lig og rydde vejen for regenerative processer 1-3. Denne creates et krav om selektiv udvælgelse af affaldshåndtering celler, der udfører fagocytotiske clearance af celledød i slagtilfælde. Når billeddannelse sådanne aktive affaldshåndtering celler, er det også vigtigt at besvare spørgsmålet om, hvor effektivt de nedbryder de opslugte celle lig. Den effektive og fuldstændig nedbrydning af døende cellens DNA i fagocytose er afgørende, fordi det forhindrer selv-immunisering og frigivelse af patologisk nukleart materiale 6.
Her præsenterer vi nye sonder, der bruger specifikke DNA pauser som markører af aktive fagocytceller. Disse signatur pauser er udelukkende produceret under nedbrydning af opslugte kerner inde funktionelle affaldshåndtering celler. Derfor sonderne selektivt mærke kun de fagocytter, at opsluge og aktivt fordøje cellulære lig. De tillader også observere intensiteten og færdiggørelse af DNA opdeling efter engulfment. Sonderne er nyttige i evalueringer af intensitet og efficitighed af fagocyterende clearance.
De nye prober er afhængige af en ikke-protein-baserede markør og kan derfor være særligt fordelagtigt i undersøgelser af slagtilfælde, hvor omfattende iskæmisk skade kan forstyrre cellulære morfologi eller nedbryder protein-baserede markører, især inde i kernen iskæmiske zone.
Princippet af teknikken er vist i fig. 1. Figuren viser hårnåle-formet oligonukleotidprober ligeres af enzymet vaccinia topoisomerase (VACC TOPO) til 5'OH DNA ender genereret af lysosomal DNase II under DNA fordøjelse 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Metoden er egnet til formaldehyd-fikserede, paraffinindlejrede vævssnit. Teknikken demonstreres her i sin ansøgning til eksperimentel slagtilfælde i rotter.
1.. Forberedelse Komponenter til System Tyramide signalforstaerkning (TSA)
Selvom TSA-baserede forstærkning anvendes i den afsluttende fase af mærkning, forberedelse til denne reaktion kan tage mere end 1 time. Derfor er det praktisk at gøre TSA reagenser før start mærkningen.
- Gør fluorophor tyramid stamopløsning. Brug fluoroforen tyramid reagenset leveres i de enkelte hætteglas med TSA mærkning kit. Tilsæt 300 pi DMSO til tyramid reagensflasken. Fluorophor tyramid stamopløsning er stabil i mindst 3 måneder ved opbevaring ved 4 ° C.
- Gør TNT wash buffer indeholdende: 0,1 M Tris-HCI, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,05% Tween-20. Hvis det er nødvendigt 0,3% Triton X-100 kan i stedet for 0,05% Tween-20. Skiftivt PBS kan anvendes som vaskebuffer.
- Gør TNB blokerende buffer indeholdende: 0,1 M Tris-HCI, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,5% blokeringsreagens (leveres med sættet). For helt at opløse blokeringsreagens, langsomt tilføje det i små intervaller i bufferen under omrøring. Opvarm opløsningen gradvist til 55 ° C under kontinuerlig omrøring. Dette kan tage 30-60 min. Løsningen vises mælket. Bring til stuetemperatur før brug. Alikvot og opbevares ved -20 ° C til lang tids brug.
2.. Udarbejdelse af Sektioner
Brug slides med påmonterede 5 um tykke snit skåret fra formalin-fikserede væv.
- Forkæl sektioner med xylen i 15 min.
- Rehydrere sektioner som følger: blød i 96% EtOH 2x i 5 min hver; lægges i blød i 80% EtOH i 5 min; vaskes af med vand 2x i 5 minutter hver.
- Gør proteinase K arbejder ved fortynding proteinase K stamopløsning til 50 mg / ml i PBS.
- Tilføj proteinaseK arbejder løsning sektioner. Inkuber 15 min ved 23 ° C. Volumenet af opløsningen og tidspunktet for spaltning kan være nødvendigt at justere afhængigt af størrelsen af sektioner og vævstyper. For en lille (under 5 mm i diameter) § 50 pi proteinase løsning ville være tilstrækkelig. For en gennemsnitlig størrelse (~ 10 mm i diameter) sektion, tilsættes 100 pi proteinase K-opløsning. For meget store dele volumenet af opløsningen kan skaleres op. I alle tilfælde sørge for at forhindre overspaltning af sektioner, som fører til fuldstændig tab af signal og ødelægger væv morfologi. Dette sker ofte, hvis inkubationstiden overstiger 25 min.
- Vask sektioner i destilleret vand 2x i 5 minutter hver. Forbered mærkning mix indeholder aktiv sonde mens sektioner er i vand.
3.. VACC TOPO-baserede Farvning
- Forbered aktive sonde løsning ved at kombinere følgende:
Vand - 11,75 pi
1 M Tris-HCI, pH 7,4 til 1,25 μl
100 pmol af 12-basen udhæng selvmord oligonukleotid - 1 pi
100 pmol af adapter oligonukleotid - 1 pi
50 pmol VACC TOPO - 10 ul - Bland forsigtigt ved pipettering. Inkuber ved stuetemperatur (23 ° C) i 15 minutter for at tillade sonden aktivering.
- Tag sektioner fra vask krukke opsuges det resterende vand. Så gælder det aktive sonde opløsning fremstillet i trin 3.1 (25 ul pr ~ 10 x 10 mm afsnit).
- Dækglas sektioner og inkuberes i 15 minutter ved 23 ° C. Dip glider i vand til forsigtigt at fjerne dækglas. Vask i vand 3x i 5 minutter hver.
4.. TSA Signal Enhancement
- Dæk vævssnit med TNB blokerende buffer fremstillet tidligere og inkuberes objektglassene i et fugtigt kammer i 30 minutter ved stuetemperatur (23 ° C).
- Forbered en 1:100 fortynding af streptavidin-peberrod peroxidasekonjugater (SA-HRP) i TNB blokerende buffer. Aspirer TNBblokeringspuffer og anvende SA-HRP-opløsning. Inkuberes slides med SA-HRP i 30 minutter ved stuetemperatur. Brug tilstrækkelig reagensvolumen at dække vævssnittet generelt er 100 pi per sektion.
- Wash slides 3x i 5 min hver i TNT vaskebuffer (eller PBS) ved stuetemperatur.
- Forbered 1:50 fortynding af fluoroforen tyramid lager i 1x Amplification Diluent fra sættet. Pipette fluoroforen tyramid arbejder løsning på hvert dias. Brug nok brugsopløsning til helt at dække vævssnittet generelt 100 ul pr sektion. Gør fluorophor tyramid arbejder løsning umiddelbart før hver mærkning. Løsningen kan ikke genbruges, så enhver ubrugte del af det kasseres efter mærkning.
- Glassene inkuberes ved stuetemperatur i 3 til 10 minutter. Overvåge fluorescens forhøjelse under mikroskop indtil de første antydninger af strukturer kan ses. Hurtigt videre til vaske trin.
- Vask slides 3x i 5 min hver i TNT vaskebuffer (eller PBS) ved stuetemperatur temperatur med omrøring.
- Tilsæt antifading løsning med DAPI og dækglas. Overhold under fluorescens mikroskop. At visualisere DAPI og FITC fluorescens bruge et band-pass filter sæt:
FITC excitation D490/40, emission 520/10; DAPI excitation D360/40, emission 460/20, eller lignende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Princippet om teknikken til mærkning aktiv affaldshåndtering fagocytter er præsenteret i figur 1.. Den skematiske viser, at afsløring provenuet i tre trin. Det første skridt omfatter sonde aktivering (figur 1A); i det andet trin den aktiverede probe ligeres til specifikke DNA pauser i vævssnit (figur 1C); det tredje trin omfatter fluorescerende signal forstærkning (figur 1D). I en mere detaljeret forklaring, afsløring går som følger:
1. Probe aktivering. Før ligeringsreaktionen behov VACC TOPO at være kovalent bundet til 3'-enden af oligoprobe. Under sonde aktivering VACC TOPO tillægger hårnål-adapter duplex og spalter den øverste streng. De 12 baser lange del herefter permanent adskiller efterlod VACC TOPO tilhæftet til 3 'enden af hårnålen. Dette oligonukleotid med enzymet bundet til sin 3'-ende kan mærke DNase II type pauser (figur 1B). Den 12-basen udhæng og en adapter oligo er nødvendige, fordi enzymet ikke vil skære en kortere streng 8 og vil derfor ikke være i stand til at knytte til sonden og aktivere sin 3'-enden.
2.. Probe ligering. Biotinylerede hårnåle ligeres ved VACC TOPO til 5'OH blunt ended DNA pauser genereret af fagocytter fordøje kerner af døde celler. De vedhæftede prober visualiseres ved fluorescens under anvendelse af tyramid ekstraudstyr 9.
3.. Florescent signalering opnås ved hjælp Tyramide Signal Amplification (TSA) 9. Under denne proces streptavidin-peberrod peroxidasekonjugater tillægger biotinylerede hårnåle og aktivere binding af fluorescerende tyramides i umiddelbar nærhed, skaber stærkt fluorescerende sites.
e_content "> Anvendelse af teknik til eksperimentel slagtilfælde er vist i fig. 2. Figur 2 præsenterer fluorescens billeder af aktive fagocytceller clearing celledød i rottehjerne 48 timer efter starten af permanent fokal hjerneiskæmi. er Cellerne mærkes af VACC TOPO sonder som beskrevet. Sonderne visualisere gigantiske phagolysosomes 10 med DNase II pauser (grøn fluorescens), mærkning fagocytter, der aktivt opsluge og fordøje celle lig 7. Samtidig co-farvning med DAPI etiketter kromatin af fagocytter og de opslugte celler inde fagocytter. Det overlejringer af VACC TOPO og DAPI signaler tillader nem identifikation og morfologisk analyse af aktive fagocytceller. For klarere præsentation, vises billederne suppleret med diagrammer over begivenhederne, der vises.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Påvisning af fagocytisk clearance i hjernen sektioner ved ligerbare sonder:. Princippet af metoden.
Figur 2 Eksperimentel slagtilfælde 48 timer efter iskæmi debut:. Fagocytotiske clearance af celledød To eksempler på fagocyterende clearance.. Ligerbare VACC TOPO sonde - grøn fluorescens. Nuklear plet DAPI - blå fluorescens. Diagrammer over de begivenheder, der præsenteres i billederne (højre kolonne) viser kerner af fagocytter og pycnotic opslugt ekstra kerner i forskellige stadier af fordøjelsen. Scale bar - 15 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne video demonstrerer vi i vævssnittet format, hvordan at mærke aktive fagocytter som klar celledød i fokal hjerne iskæmi. Den præsenterede teknik er den første metode, som specifikt etiketter kun de affaldshåndtering celler, som er opslugt og aktivt fordøje cellulære lig. Dette gør det fordelagtigt med hensyn til andre eksisterende metoder til mærkning af fagocytiske celler, som ikke har denne evne.
Den metode bruger en generel og selektiv DNA-baseret markør for fagocyterende aktivitet - dobbeltstrenget, stumpendede 5'OH DNA pauser produceret i phagolysosomes af affaldshåndtering celler under fordøjelsen af opslugte kerner. Denne specifikke mærkning af kun aktive fagocytceller tillader nøjagtig vurdering af intensiteten og effektiviteten af fagocyterende reaktion i iskæmisk hjerne.
Teknikken er robust og fungerer godt, hvis alle trin følges som beskrevet. Proteinase K fordøjepå trin er særligt vigtigt for en stærk og reproducerbar farvning. Overspaltning på dette trin fører til tab af DNA fra sektionen og kan nedsætte eller endog eliminere signalet. Det andet kritiske punkt er at bruge en meget aktiv forberedelse af vaccinia topoisomerase enzym. En begrænsning ved teknikken er, at det ikke er optimeret til anvendelse med frisk frosne sektioner.
Den tilgang har bred anvendelighed til studier af apoptose og kan udvides til andre væv og vilkår uden iskæmisk hjerne. Det er især praktisk, når den bruges til visualisering af fagocytotiske reaktioner i væv og organer består af flere celletyper med forskellige deltagende affaldshåndtering celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af tilskud R01NS062842 fra National Institute of Neurologiske og slagtilfælde, National Institutes of Health (VVD) og ved tilskud R21 NS064403 fra National Institute of Neurologiske og slagtilfælde, National Institutes of Health gennem arra (VVD) og R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging og Bioengineering, National Institutes of Health (VVD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- TSA Fluorescence Systems. , Available from: http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73609man_TSAFluorescenceSystems.pdf Forthcoming.
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
