Medição Longitudinal de Matriz Extracelular Rigidez em 3D tumorais modelos com o uso de rastreamento de partículas Microrheology

Summary

-Tracking microrheology partícula pode ser usada para quantificar de forma não destrutiva e espacialmente mapear as alterações nas propriedades mecânicas da matriz extracelular em modelos de tumor em 3D.

Abstract

O microambiente mecânica tenha sido mostrado que actua como um regulador essencial do comportamento de crescimento tumoral e a sinalização, que é em si remodelada e modificada como parte de um conjunto de interacções, bidireccional mechanosensitive complexos. Enquanto o desenvolvimento de modelos de tumor 3D biologicamente relevantes tenham facilitado os estudos mecanísticos sobre o impacto da reologia da matriz sobre o crescimento do tumor, o problema inverso de alterações de mapeamento do ambiente mecânica induzida por tumores permanece um desafio. Aqui, descrevemos a implementação de rastreamento de partículas microrheology (PTM), em conjunto com modelos 3D de câncer de pâncreas, como parte de uma abordagem robusta e viável para monitorar longitudinalmente mudanças físicas no microambiente tumoral, in situ. Esta metodologia integra um sistema de preparação in vitro modelos 3D incorporados em uma matriz extracelular modelo (ECM) andaime de colágeno tipo I com sondas marcadas com fluorescência distribuída uniformemente para pomedições microrheology dependentes do tempo em todo o espécime ção-e. in vitro tumores são banhados e sondado em condições paralelas usando placas de imagem multipoços. Baseando-se em métodos estabelecidos, vídeos de movimentos sonda traçadores são transformados através da Relação Generalizada Stokes Einstein (GSER) para relatar o módulo de cisalhamento complexo viscoelástico dependente da freqüência, G * (ω). Como essa abordagem é baseada em imagem, caracterização mecânica também é mapeado sobre grandes campos espaciais de luz transmitida simultaneamente para relatar mudanças qualitativas no tamanho e fenótipo tumoral 3D. Os resultados representativos mostrando contrastante resposta mecânica em sub-regiões associadas com a degradação da matriz localizada induzida por invasão, bem como a calibração do sistema, dados de validação são apresentados. Também são apresentados os resultados indesejáveis ​​de erros experimentais comuns e solução de problemas dessas questões. O formato cultura chapeamento 3D de 96 poços implementado neste protocolo é conducive a correlação de medições microrheology com testes de rastreio terapêuticos ou de imagem molecular para ganhar novos insights sobre o impacto de tratamentos ou estímulos bioquímicos no microambiente mecânica.

Introduction

Fica claro a partir de um crescente corpo de evidências na literatura de que as células cancerosas, como acontece com as células epiteliais de mamíferos não-malignas, são altamente sensíveis às propriedades mecânicas e biofísicos da matriz extracelular circundante (ECM) e outros componentes do microambiente ^1-9. Estudos sobre os mecanismos elegantes forneceram insights sobre o papel da rigidez extracelular como um parceiro de sinalização mechanosensitive complexo que regula o comportamento crescimento maligno e morfogênese ^2,3,10,11. Este trabalho foi facilitado, em especial, pelo desenvolvimento de 3D ​​em modelos tumorais in vitro que restauram biologicamente arquitectura dos tecidos relevantes e podem ser cultivadas em materiais de andaime com mecânicos ajustáveis ​​e fotografada por microscopia óptica ^12-19. No entanto, o outro lado dessa caixa de diálogo mechanoregulatory entre tumor e microambiente, através do qual as células cancerosas, por sua vez alterar a reologia de seu entorno, permanece um tantomais difíceis de estudar. Por exemplo, durante os processos de invasão, as células na periferia do tumor podem sofrer epitelial para mesenquimal (EMT) e aumentar a expressão de metaloproteases de matriz (MMPs), que provocam a degradação do local ECM ^20-22, que por sua vez influenciam o comportamento de crescimento de mechanosensitive outras células tumorais proximais. Através de uma variedade de processos bioquímicos, células cancerosas discar continuamente a rigidez local do seu meio ambiente para cima e para baixo para se adequar a diferentes processos em momentos diferentes. A metodologia descrita aqui é motivado pela necessidade de ferramentas analíticas que relatam alterações locais na rigidez e conformidade do ECM durante o crescimento, que podem ser integrados com modelos de tumor 3D e correlatos longitudinalmente com alterações bioquímicas e fenotípicas sem terminar a cultura.

Em busca de uma técnica adequada para implementar neste contexto, microrheology partícula-tracking (PTM) emerge como um forte candidato.Este método, foi pioneira originalmente por Mason e Weitz ^23,24, usa o movimento de sondas de rastreamento incorporado em um fluido complexo para relatar o complexo módulo dependente da freqüência viscoelástico de cisalhamento, G * (ω) em escalas de comprimento micro. Esta abordagem geral foi desenvolvido com múltiplas variações adequadas para diferentes aplicações em soft-Matéria Condensada, colóides, biofísica e física polímero ^25-31. PTM tem certas vantagens em relação a outros métodos, uma vez que as leituras da viscoelasticidade local são fornecidos pela imagem de vídeo não-destrutiva das sondas marcadoras bioquimicamente inactivos que são incorporados no momento da preparação da cultura e permanecem no lugar durante longos períodos de crescimento. Isto está em contraste com as medições padrão de ouro com um reómetro de cisalhamento oscilatório a granel, o que requer, necessariamente, de terminação da cultura e relata a reologia macroscópica volume da amostra, em vez de medições pontuais dentro do tumor microenvir 3D complexoente. De fato, vários estudos têm ilustrado a utilidade de interpretar as medições dos movimentos da sonda tracer ou em torno de células de câncer ou não câncer de medir deformações associadas com a migração de células ^32, estresse mecânico induzido por um esferóide expansão ^33, reologia intracelular ^34,35, e mapear tensões mecânicas e deformações em tecidos artificiais ^36, e relação entre o tamanho dos poros e velocidade invasão ^37. Outras técnicas adequadas para microrheology, como a microscopia de força atômica (AFM) pode ser implementado, mas principalmente para os pontos de sondagem na superfície da amostra e também podem representar problemas de esterilidade da cultura que complicam medições longitudinais ^38.

Aqui, nós descrevemos um protocolo abrangente que inclua métodos para o crescimento do tumor de esferóides 3D aptos a serem transferidos em ECM com sondas fluorescentes embutidas para vídeo partícula de rastreamento e análise de métodos para o mapeamento confiável espacialmudanças na microrheology mais tempo em cultura. Na presente implementação, modelos de tumores em 3D são cultivadas em formato de vários poços com vistas à incorporação de medidas microrheology com outros ensaios tradicionais (por exemplo, de citotoxicidade), que este formato é propício para. Nesta ilustração representativa de essa metodologia de cultura in vitro esferóides 3D utilizando PANC-1 de células, de uma linha celular de cancro pancreático estabelecido conhecido para formar esferóides ^39, mas todas as medições aqui descritas são amplamente aplicável ao estudo de tumores sólidos utilizando uma variedade de linhas celulares adequado para cultura 3D. Como esse método é baseado em imagem latente inerentemente é ideal para co-registro de dados microrheology de alta resolução com grandes campos de luz transmitida de vista que relatam alterações no crescimento celular, migração e fenótipo. A implementação da PTM integrado com microscopia de luz transmitida desta forma assume posicionamento reprodutível dos wh estágio do microscópioich está normalmente disponível em epifluorescência widefield comercial microscópios biológicos motorizados. O protocolo desenvolvido abaixo pode ser implementado com qualquer fluorescência automatizada microscópio biológico a equipados. Este é um método intensivo de dados inerente, o que exige a aquisição de gigabytes de dados de microscopia de vídeo digitais para processamento offline.

No seguinte protocolo, Protocolo 1 refere-se a uma preparação inicial de esferóides de tumor que é descrito aqui, utilizando sobreposição de agarose, mas podem ser substituídos com uma variedade de outros métodos, tais como a gota em suspensão ^40, ou cultura rotativa ⁴¹ técnicas. Protocolo 2 descreve o processo de incorporação de esferóides de um andaime do colagénio embora alternativamente, in vitro tumores 3D pode ser cultivada por encapsulação ou a incorporação de células ressuspensas em ECM ^12,15, em vez de simples esferóides não aderentes pré-formados. Protocolos subsequentes descrevem os procedimentos para obtaining medições microrheology resolvida no tempo através da aquisição e processamento de dados de microscopia de vídeo, respectivamente. O processamento de dados é descrito usando MATLAB, fazendo uso de rotinas de código aberto para a PTM construído em algoritmos originalmente descritos por Crocker e Grier ^42, que também foram amplamente desenvolvidos para diferentes plataformas de software (ver http://www.physics.emory.edu/ ~ semanas / IDL /).

Protocol

1. Esferóides Cultivar tumorais Misturar 10 ml de água de grau de cultura de células com 0,1 g de agarose para obter uma solução de agarose a 1%. Solução de agarose de calor acima dos 70 ° C (cerca de 14 segundos num forno de microondas padrão ou usando uma placa de aquecimento) antes de alíquotas de 40 ul de solução de agarose a um poço numa placa de 96 poços. Incubar a placa a 37 ° C durante pelo menos 1 hora, enquanto a colheita de células utilizando técnicas padrão. <…

Representative Results

Para verificar a validade do G * (ω) medições em posições localizadas dentro de um microambiente do tumor modelo complexo, dois experimentos de validação iniciais foram realizados. Em primeiro lugar, procurou-se validar nossas medidas contra o "padrão ouro" de reometria de cisalhamento oscilatório granel. Foram preparadas amostras idênticas de matriz de colagénio (sem células) a uma concentração de colagénio de 1,0 mg / ml. Estas amostras foram sondadas com um reómetro de massa (TA Ins…

Discussion

Neste protocolo, apresentamos uma estratégia robusta e amplamente aplicável para longitudinalmente rastreamento de alterações locais na ECM rigidez em modelos de tumores em 3D. Nós prevemos que esta metodologia poderia ser adotada por biólogos câncer e biofísicos interessadas em comportamento mechanosensitive implicados na remodelação da matriz durante o crescimento de tumores e processos de invasão. A quantificação precisa da cinética de degradação da matriz poderia ser particularmente útil para aquele…

Materials

Bovine type 1 collagen	BD Biosciences, San Jose, California	354231
PANC-1	American Type Cell Culture, Manassas, VA	CRL1469	or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres	Life Technologies, Carlsbad, California	906906
Matrigel	BD Biosciences, Bedford MA	354230
Agarose	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
96-well Imaging plates	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	or appropriate  cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software	The Mathworks, Natick, MA