L'incapsulamento di trascrizione privo di cellule e macchinari traduzione in vescicole per la costruzione di Mimics cellulari

Summary

Qui descriviamo semplici metodi per la preparazione di vescicole, l'incapsulamento di trascrizione e traduzione macchinari, e il monitoraggio della produzione di proteine. La risultante sistemi cell-free possono essere utilizzati come punto di partenza da cui costruire imita cellulari sempre più complessi.

Abstract

Come spostamenti interesse da singole molecole a sistemi di molecole, un numero crescente di laboratori hanno cercato di costruire dal basso imita cellulari che meglio rappresentano la complessità della vita cellulare. Ad oggi ci sono una serie di percorsi che potrebbero essere adottate per costruire imita compartimenti cellulari, compreso lo sfruttamento delle emulsioni acqua-in-olio, dispositivi microfluidici, e vescicole. Ognuna delle opzioni presenta vantaggi e svantaggi specifici. Ad esempio, emulsioni acqua-in-olio sono ad alto rendimento incapsulamento ma non imitano bene la barriera di permeabilità delle cellule viventi. Il vantaggio principale dei metodi qui descritti è che sono tutti facili ed economici da realizzare. Meccanismi di trascrizione-traduzione è incapsulato all'interno di vescicole fosfolipidiche attraverso un processo che sfrutta strumentazione comune, come ad esempio un evaporatore centrifugo e un estrusore. Le reazioni sono monitorati mediante spettroscopia di fluorescenza. Il protocollos può essere adattato per l'espressione di proteine ​​ricombinanti, la costruzione di imita cellulari, l'esplorazione dei requisiti minimi per la vita cellulare, o l'assemblaggio di circuiti genetici.

Introduction

Privo di cellule, in vitro le reazioni di trascrizione-traduzione e la generazione di vescicole di lipidi sintetici sono nulla di nuovo. Tuttavia, combinando i due in un cellulare imitare è significativamente più challenging1-6. E. coli estratti cellulari con o senza T7 RNA polimerasi possono essere utilizzati come fonte di meccanismi di trascrizione-traduzione ^7,8. Estratti cellulari beneficio dalla presenza di componenti cellulari aggiuntivi che possono facilitare l'espressione proteica e pieghevole. In alternativa, una miscela di RNA purificati individualmente e molecole proteiche, cioè il sistema PURE ^9, può essere usato per mediare la sintesi proteica intravesicular ^4,10-14. Il sistema PURE permette la costruzione di mimici cellulari completamente definite e non soffre l'attività nucleasi trovato in estratti cellulari. In pratica, ciò significa che è necessario molto meno stampo di DNA, facilitando così i processi a bassa efficienza di incapsulamento ¹¹ </sup>. Anche se meno frequente, imita cellulari possono essere costruiti con estratti di cellule derivate da eucarioti cells15. Finora, cascate incapsulati geneticamente codificate e mima cellulari che percepiscono l'ambiente sono stati segnalati ^16-18.

Il modo più semplice per monitorare le reazioni di trascrizione-traduzione è quello di misurare la fluorescenza o luminescenza di elementi geneticamente codificati. Tipicamente, lucciola luciferasi ¹⁹ o GFP sono utilizzati, anche se in vitro reazioni sono frequentemente misurate da radiomarcatura. Rilevazione a fluorescenza consente inoltre il monitoraggio delle popolazioni di vescicole ^20,21 attraverso metodi basati citometria, offrendo così un po 'di comprensione della natura stocastica dei processi biologici simili. Questi metodi di controllo sono stati utilizzati per definire un piccolo insieme di regole di progettazione e di una libreria di parti da cui costruire, includendo una collezione di proteine ​​fluorescenti che sono compatibili con in vitro trascrizione-traduzione ^22, l'influenza di organizzazione genetica sull'espressione ^22, l'attività dei fattori sigma ^16, e l'efficienza trascrizionale terminatori ^23. Tuttavia, c'è ancora molto che deve essere fatto per aumentare la capacità di costruire prevedibile in vitro, dispositivi geneticamente codificati.

Ci sono molti metodi disponibili per fare vescicole. I metodi più comuni dipendono dalla generazione di un film lipidico sottile su una superficie di vetro seguita da risospensione in solution24 acquosa. Se la soluzione acquosa contiene meccanismi di trascrizione-traduzione, per esempio, allora una frazione delle vescicole formato dovrebbe contenere i componenti necessari per la produzione di proteine. Tuttavia, l'efficienza di incapsulamento di tali metodi è bassa, il che significa che solo una piccola percentuale di vescicole sono attivi. Molti dei metodi alternativi caratterizzati da molto superiore eff incapsulamentoiciency sfruttare la conversione di goccioline di emulsione acqua-in-olio di vescicole. Mentre è probabile che tali metodi saranno all'ordine in futuro, attualmente questi metodi soffrono la necessità di attrezzature specializzate e danno vescicole di membrana con composizioni alterati ^25. Un vantaggio di acqua-in-olio ai metodi vescicole è il potenziale di membrana di controllare lamellarity. Il metodo qui descritto è basato sul protocollo sottile film lipidico descritto dal laboratorio Yomo ¹¹ con lievi modifiche, compresa una fase di omogeneizzazione aggiuntiva. Questo metodo è facile, economico, e dà vescicole robusti e adatti per l'incapsulamento dei meccanismi di trascrizione-traduzione.

Protocol

1. Preparazione del modello di DNA Purificare plasmide da un ceppo standard di laboratorio di E. coli, come E. coli DH5a o Nova blu con un kit commerciale. Alternativamente, un prodotto di PCR lineare può essere purificato in modo simile con un kit commerciale. Eluire il DNA con H 2 O solo. Fenolo-cloroformio estrarre la soluzione di DNA 26. Determinare la concentrazione di DNA e la purezza, ad esempio mediante assorbimento UV o altri metodi idonei. È importante utilizzare il DNA altamente puro per efficiente trascrizione-traduzione. 2. Preparazione del Thin Film Lipid Pesare la polvere secca lipidica e sciogliere in solvente. Per 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), le soluzioni madre sono preparati in cloroformio ad una concentrazione di 40 mg / ml. Nota: Solventi organici devono essere sempre maneggiati con pipette di vetro e bottiglie. In altre parole, non deve mai essere usata plastica. Conservare ssoluzioni tac in stretto, bottiglie di vetro aria solvente resistenti ambra a -20 ° C, preferibilmente sotto argon. Aliquota 12 micromol POPC (220 ml di 40 mg / ml di soluzione) in un pallone a fondo tondo da 5 ml. Evaporare il solvente con un evaporatore rotante (Figura 1) per generare il sottile film lipidico. Montare saldamente il pallone al tubo di distillazione con un fermaglio circolare e avviare la rotazione del pallone. Avviare la circolazione di acqua attraverso la serpentina del condensatore. Utilizzando un bagno di calore non è necessario, perché cloroformio ha un basso punto di ebollizione di 61,2 ° C a pressione atmosferica normale. Assicurare che il sistema è aperto all'atmosfera controllando che il rubinetto è aperto. Accendere la pompa del vuoto e chiudere lentamente il rubinetto di applicare il vuoto al sistema. Un sottile film lipidico si deposita sulle pareti del pallone durante evaporazione rotante formando una pellicola opacache è visibile ad occhio. Lasciate che l'evaporazione rotante proseguire per 0,5-2 ore. Per arrestare il processo, rilasciare lentamente la pressione del vuoto, fermare la rotazione, e togliere il pallone a fondo tondo. 3. Lipid risospensione e Vesicle omogeneizzazione Aggiungere 1 ml 18,2 MW H 2 O al film lipidico sottile direttamente nel pallone a fondo tondo. Vortice vigorosamente la soluzione alla massima velocità, circa 3.200 rpm, finché il film lipidico stacca dal vetro, che è osservabile ad occhio. Trasferire la dispersione dei lipidi in una provetta da 2 ml. Set-up di un anello stand per tenere un omogeneizzatore con una punta di 5 mm. Posizionare un supporto sotto il microcentrifuga omogeneizzatore per tenere saldamente la dispersione dei lipidi. Risciacquare l'elemento disperdente del omogeneizzatore immergendo la punta in 18,2 MW H 2 O e funzionante per alcuni secondi. Posizionare l'elemento disperdente direttamente nella dispersione lipidica garantendo thsulla punta non tocchi il fondo della provetta. Omogeneizzare per 1 min a livello di potenza 4 o 14.000 rpm. 4. Vescicola Estrusione e liofilizzazione Assemblare le parti della mini-estrusore (Figura 2), che consiste in un involucro esterno e un dado di bloccaggio che ospita due membrane teflon interno supporta, due O-ring, e un cuscinetto Teflon. Posizionare i due O-ring nelle scanalature dei supporti membrane interne. Prewet due filtri e una membrana 400 nm. I filtri saranno collocati contro il Teflon all'interno degli O-ring con la membrana tra loro. Posizionare la membrana supporta nella guaina estrusore con la membrana circondato da due filtri in fra gli O-ring. Posizionare il cuscinetto in teflon all'interno del carter e fissare il dado di fermo e serrare a mano. Risciacquare due siringhe e riempire uno con 18,2 MW acqua. Inserire gli aghi della siringa nel piccolo holes in teflon su entrambe le estremità del gruppo estrusore. Gli aghi devono scivolare nel facile, non forzare gli aghi. Fissare l'estrusore con le siringhe nel corpo estrusore e fissare. Passare l'acqua attraverso l'estrusore premendo lentamente l'acqua fuori una siringa e nell'altro. Questo rappresenta un passaggio. Ripetere per un totale di tre passaggi di assicurare che non vi siano perdite presenti. Rimuovere la siringa di acqua e smaltire l'acqua. Riempire una siringa con il campione, allegare l'estrusore, e lentamente passare la soluzione attraverso la membrana vescicola come descritto sopra nel passo 4.3. Ripetere 10 volte per un totale di 11 brani. Dell'andamento del processo di estrusione, il campione diventa meno torbido e facile spingere attraverso la membrana. Una improvvisa diminuzione della resistenza, comunque, di solito indica una rottura della membrana. Trasferire la soluzione vescicola estruso e fare 40 microlitri aliquote delle vescicole in provette da microcentrifuga.Flash congelare ciascuna aliquota in ghiaccio secco o in azoto liquido. Lyophilize ciascuna aliquota con un evaporatore centrifugo notte a 30 ° C. Conservare le vescicole vuote liofilizzate a -20 ° C. 5. Incapsulando meccanismi di trascrizione-traduzione Miscelare i componenti della reazione di trascrizione-traduzione e aggiungere 20 unità di inibitore della RNasi. Incubare in ghiaccio. Aggiungere il modello di DNA. Per una reazione di controllo, 250 ng di plasmide mVenus codifica una proteina fluorescente o simile dietro un promotore trascrizionale T7 e un forte E. coli sito di legame del ribosoma è raccomandato. Portare il volume finale di 25 microlitri di acqua priva di RNasi. Idrato una aliquota di vescicole liofilizzati (dal punto 4.6) con 10 microlitri della reazione assemblato nel passo 5.3. Brevemente vortex la miscela fino a quando le vescicole sono risospesi. Questo dovrebbe richiedere meno di 30 sec. Incubare la reazione in ghiaccio per 30 min per permettere le vescicole a gonfiarsi. Diluire la miscela vescicola 20 volte ad un volume totale di 30 microlitri con l'aggiunta di 1,5 ml di vescicole in 27,0 ml di 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4 e 1,5 ml di 20,2 mg / ml di proteinasi K. DNasi e RNasi possono anche essere aggiunti a questo punto come alternativa alla proteinasi K a degradare materiale extravesicular. Incubare per almeno 2,5 ore a 37 ° C. 6. Microscopia Esaminare le vescicole e il progresso della produzione di proteina fluorescente in momenti diversi. Le vescicole avranno un diametro maggiore rispetto alle 400 nm pori di dimensioni della membrana utilizzata per vescicola estrusione. Preparare una camera del campione mettendo un 20 x 5 mm distanziale di silicio su un vetrino da microscopio standard. Pipettare 10 ml di vescicole nell'apposita camera. Posizionare un vetrino di vetro siliconato sopra la camera. Osservare le vescicole con un 63X olio-dispersione or obiettivo analogo da campo chiaro e microscopia a fluorescenza con filtro corrispondente per la proteina fluorescente sfruttati.

Representative Results

Microscopia di fluorescenza che rivela la fluorescenza si osserva solo all'interno delle vescicole, perché il materiale extravesicular è enzimaticamente degradata (Figura 3). Per l'espressione di mVenus, intravesicular fluorescenza comincia ad essere osservata dopo 1,5 ore a 37 ° C e raggiunge l'intensità di fluorescenza massima entro 6 ore. La temperatura ottimale e il tempo di incubazione può variare a seconda dei costrutti specifici utilizzati. Per esempio, le proteine ​​fluorescenti diverse maturano in modo diverso in un modo dipendente dalla temperatura. In altre parole, l'osservazione della produzione di proteine ​​non è solamente dipende sintesi proteica e ripiegamento, ma anche sulla formazione cromoforo. Sintesi proteica generale può essere aumentata incorporando pori proteine ​​di membrana per permettere un afflusso di componenti impoverito necessari per la trascrizione e la traduzione 27. Si consiglia di effettuare un analogo trascrizione-traduzionizione reazione in assenza di vescicole a garantire che il costrutto genetico sfruttati è funzionale. Questa reazione di controllo è più facilmente monitorato mediante spettroscopia di fluorescenza anziché microscopia. Figura 4 mostra una reazione di trascrizione-traduzione in vitro di un costrutto mVenus codifica. Le reazioni non incapsulata danno totale intensità molto maggiore fluorescenza di reazioni intravesicular simili. Questo è dovuto alla efficienza di incapsulamento e poiché il volume totale intravesicular è molto inferiore al volume extravesicular (cioè un effetto di diluizione). Figura 1. L'evaporatore rotante e pompa del vuoto. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita . <p class="jove_content"fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 2. L'involucro e parti dell'estrusore sono mostrati separatamente. Da sinistra a destra, la siringa, il dado di fermo, cuscinetto in teflon, membrana interna supporta con O-ring nero uno di fronte all'altro, estrusore tubo esterno e seconda siringa. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita . Figura 3. Immagini di fluorescenza di produzione di proteine ​​mVenus in liposomi A e C:.. Immagini in campo chiaro di vescicole multilamellari dopo 1,5 ore e 2,5 ore e B &# 160; D: La produzione di mVenus è visualizzato mediante fluorescenza (di colore verde), dopo 1,5 e 2,5 ore, rispettivamente. Barra di scala è di 20 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita . Figura 4. Nella reazione di controllo vitro di nonencapsulated trascrizione in vitro e la traduzione di mVenus. Intensità di fluorescenza è stata misurata ogni 5 min oltre 4 ore. I dati sono stati acquisiti con uno strumento Real-Time PCR. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Discussion

Anche se la biologia sintetica privo di cellule è ancora nella sua infanzia, i progressi hanno gettato le basi da cui sempre più complessi sistemi di cellule simili possono essere fatte. La ricostituzione di meccanismi di trascrizione-traduzione da completamente definita componenti ⁹ all'interno di vescicole ²⁸ è stato particolarmente significativo nel facilitare gli sforzi successivi nella costruzione artificiale sensibile ambientalmente cells17, 18. Allo stesso modo, gli studi sulle cellule artificiali sono stati utilizzati per sondare i processi evolutivi ^4,29,30, i dettagli meccanicistici di RNA e proteine ^​​22,31, le influenze di metabolica load32, 33, e l'assemblaggio delle particelle virali ^34. È importante sottolineare che, abbastanza Ormai sappiamo che le funzioni cellulari di base può essere ricostituita all'interno di vescicole in laboratorio seguendo questi precedenti relazioni ei protocolli descritti nel presente documento.

Oltre ad essere facile, l'incapsulamento descritto procedure ha diversi vantaggi. Ad esempio, molti vuoti, aliquote vescicola liofilizzati possono essere fatte in anticipo e conservati a -20 ° C per un uso successivo. Il protocollo non soggette molecole biologiche ai solventi organici, sbalzi di temperatura, o lunghi periodi di dialisi. Ci aspettiamo che la dolcezza della procedura faciliterà l'integrazione di componenti aggiuntivi, se necessario. Inoltre, non abbiamo osservato effetti negativi per cambiare la composizione lipidica della membrana su incapsulamento o efficienza di trascrizione-traduzione. Pertanto, concettualmente, potrebbe essere sfruttata lipidi più suscettibili alla incorporazione di proteine ​​di membrana, morfologie specifiche, o di visualizzazione.

La maggiore limitazione del metodo descritto è che le vescicole risultanti non sono omogenee in dimensioni o lamellarity. Per molte applicazioni, queste difficoltà non interferiscono con l'interpretazione dei dati. Tuttavia, se necessario, ulteriori passi possono essere incorporati a stretto thdistribuzione delle dimensioni di posta e diminuire gli strati di membrane, come i cicli di estrusione dopo incapsulamento, gelo-disgelo, o dialisi ^35. Saranno sviluppati metodi indubbiamente meglio che eludono questi e altri problemi. Fino ad allora, troviamo il protocollo qui descritto per essere adatto per la costruzione di mimici cellulari.

Materials

Quick Spin Mini-prep kit	Qiagen	27104
Spectrometer	NanoDrop 1000	NDB767ND
POPC	Avanti Polar Lipids	770557	MW 760 g/mol Transition Temp -2 °C CAS# 26853-31-6
Ethanol	Sigma Aldrich	459836	Anhydrous, >99.5%
Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use	Sigma Aldrich	P3803-100mL	Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA
Chloroform	Biotech Grade Fluka	496189-1L	Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer
Brown amber glass bottles	VWR	89043-518	55X 48 mm
Rotary evaporator	Buchi Rotovapor R-210/Sigma	Z563846EU-1EA	With jack and water bath, 29/32 joint 240 V
Analog vortex mixer	VWR	945300	Speed 1,000-3,200 rpm
Homogenizer	IKA T10 Basic Ultra-Turbax	3420000
Mini-extruder	Avanti Polar Lipids	610020
Extruder filters	Whatman	610014	drain disc 10 mm
Extruder polycarbonate membrane 400 nm	Whatman	61007	nuclepore polycarbonate
Speed vacuum	Labconco	7970011	Centritrap DNA concentrator
PURExpress kit	New England Biolabs	NRM #E6800S
RNAse inhibitor (40,000 U/ml)	New England Biolabs	#M0307S
Proteinase K (20.2 mg/ml)	Fermentas	#EO0491
Microscope	Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera
RealTime	CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)
Silicon press to seal  -Molecular Probe	Life Technologies	P18174	Resistant from  -25-30 °C
Siliconized glass circle cover slides	Hampton Research	HR3-231	Diameter= 22 mm
ImageJ	NIH