Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים
Summary
מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לצלחות 384 גם הוא תאר. פורמט חסכוני זה צריך להיות שימושי בתחומי deimmunization חלבון ועיצוב חיסון ופיתוח.
Abstract
מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב 1,2. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC II ישתנה לפורמט 384 גם. פרוטוקול scaled למטה מפחית עלויות מגיב על ידי 75% ותפוקה גבוהה יותר מאשר שתואר קודם לכן פרוטוקולי 96 היטב 1,3-5. באופן ספציפי, תכנון הניסוי מאפשר ניתוח חזק ושחזור של עד 15 פפטידים נגד אחד אלל MHC II לכל צלחת ELISA 384 גם. באמצעות רובוט טיפול נוזל יחיד, שיטה זו מאפשרת לחוקר אחד כדי לנתח כ תשעים פפטידים מבחן בשלושה עותקים על פני טווח של שמונה ריכוזים וארבעה סוגי MHC II אלל בפחות מ 48 שעות. אחרים עובדים בתחומי deimmunization חלבון או עיצוב ופיתוח חיסון עשויים למצוא את הפרוטוקול כדי להיות שימושי בהנחיית העבודה שלהם. בפרט, הוראות והפורמט ויזואלי צעד אחר צעדשל יופיטר צריך לאפשר למשתמשים אחרים, כדי לקבוע במהירות ובקלות במתודולוגיה זו במעבדות שלהם.
Introduction
חלבונים הם ברמת הצמיחה המהירה ביותר של סוכנים טיפוליים 6, וההתרחבות המהירה של צינורות biotherapeutic התמקדה תשומת לב הולכת וגובר על האתגרים הקשורים בהתפתחות ושימוש בתרופות חלבון. שיקול אחד ייחודי נובע מהעובדה כי במערכת חיסונית בריאה ומתפקדת, כל החלבונים תאיים נדגמים על ידי תאי המציגים אנטיגנים (נגמ"שים). הפנים פעם על ידי נגמ"שים, חלבון הוא ביקע לרסיסי פפטיד קטנים, ומגזרי immunogenic משוערים נטענים לתוך החריץ של הכיתה השנייה חלבונים עיקריים histocompatibility המורכבים (MHC II). פפטיד-MHC II מתחמים לאחר מכן מוצגים על פני APC, ופפטידים immunogenic אמיתיים, המכונים אפיטופים תא T, יצירת קומפלקסי קולטן תא משולש MHC II-peptide-T עם קולטנים בתא שטח מאותו מקור T מסוג CD4 7. אירוע הוקרה זה קריטי מולקולרי יוזם מפל מורכב איתות, שהתוצאה של הפעלת תאי T, את שחרורו של ציטוקיניםים, התבגרות תא T מסוג CD4 תא בתיווך ב ', וסופו של דבר ייצור של מחזורי נוגדני IgG אשר נקלטות על ידי ולנקות את חלבון אקסוגני הפוגע. לפיכך, חלבוני immunogenic עשויים להיות deimmunized ידי זיהוי אפיטופים תא T מכונן ומוטצית שאריות מרכזיות שהיו אחראיות להיווצרות מורכבת MHC II. זה ראוי לציין, עם זאת, כי אפיטופים תא T יכולים להיות רבים ורחב בפריסת חלבוני immunogenic, והרוב המכריע של מוטציות מחיקה-epitope עלול לגרום לאובדן לא מכוון של תפקוד חלבון או יציבות. לכן, הנדסת deimmunized biotherapies יכול להיות אובייקטיבי מורכבת ומאתגרת מבחינה טכנית, אך קיימות מספר דוגמאות לפרויקטים המוצלחים T epitope תא מחיקה 3,5,8-12. שלא כמו "האנשה" המבוסס על השתלה, אשר מוגבלת במידה רבה לרפויות נוגדן, מחיקת epitope יכולה להיות מיושמת למעשה כל יעד חלבון ללא קשר לרצף, מבנה, תפקוד, או הזמינות של homologoשלנו פיגומים אנושיים. הצעד הראשון ליישום גישה כזו הוא זיהוי של אפיטופים פפטיד מפתח מוטבעים בתוך רצף חלבון המטרה.
מבחני ביוכימיים תפוקה גבוהה באמצעות פפטידים סינטטיים ומולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות ראשוניות מהירה לזיהוי אפיטופ והפחתה 1,3-5. מבחני מסוג ELISA אלה יכולים להיות חזק כדי להשלים כלי עיצוב ופיתוח חלבון / חיסון אחרים. לדוגמא, אחד גישה ניסויית מבוססת היטב למיפוי epitope מסתמכת על זמן, עבודה ומשאבי מבחני אינטנסיביים vivo לשעבר התפשטות תאי 15. בקצרה, הרצף הראשוני של חלבון מטרה מחולק ראשונה לפנל של פפטידים חופפים, לעתים קרובות 15 מרס עם 12 שאריות חפיפה בין פפטידים סמוכים. פנל פפטיד הוא סינתזה כימית וimmunogenicity של כל הפפטיד נבדק באחד מכמה immunoassays שונה המעסיקות bloo ההיקפיתאים מונונוקלארים ד (PBMC) מבודדים מתורמים אנושיים 13,14. כדי לספק ביטחון רב יותר בתוצאות, פפטידים שנבדקו בדרך כלל בלשכפל עם PBMC מ50 או יותר תורמים שונים. במקרים בהם deimmunization הוא המטרה הסופית, העבודה מורכבת עוד יותר על ידי הצורך לייצר פנלים נוספים של פפטידים שעברו מוטציה ולבדוק את לוחות פפטיד החדשים במבחני PBMC לפני החדרת כל מוטציות deimmunizing לחלבון באורך מלא עבור הניתוח פונקציונלי הבא 10. בעוד מבחני הסלולריים אלה נשארים תקן הזהב להערכת פוטנציאל immunogenic בחולים אנושיים, את היעילות של גישה כזו ממצה ניתן לשפר על ידי prefiltering אפיטופים immunogenic משוערת באמצעות תפוקה מהירה וגבוהה assay מחייב MHC II-peptide.
כמו כן, ניתן לשלב מבחני פפטיד-MHC II ביוכימיים מחייבים עם חזוי בשיטות סיליקו כדי להאיץ את תהליך זיהוי אפיטופ באופן קיצוני.קיים מגוון רחב של כלים חישוביים לחיזוי epitope תא T; דוגמאות כוללות 16 ProPred, 17 MHCPred, 18 SVRMHC, ARB 19, SMM ליישר 20, NetMHCIIpan 21 כמו גם כלים קניינית כגון EpiMatrix ידי 22 EpiVax. כמו כן, מנבאי epitope לאחרונה בשילוב עם ביואינפורמטיקה וכלים אחרים הדמיה מולקולריות להניב אלגוריתמי deimmunization משולבים חלבון שנועדו לצמצם את הסיכון שמוטציות deimmunizing עלולות לשבש את מבנה חלבון ותפקוד 23-26. בעוד כמה מנבאי epitope הוכיחו להיות 27,28 מדויק למדי, תוצאות חישובית תמיד דורשות אימות ניסיוני. שיטות ניסיוניות מהיר, תפוקה גבוהה, וחסכונית הם מתאימים ביותר כמסנן ראשוני לתחזיות epitope סיליקו.
ברוח דומה, מנבאי epitope יכולים לנהוג בחירת אנטיגן לvaccinolo ההפוךGY 29,30. לדוגמא, התקדמות ביואינפורמטיקה הניבה מסכי הגנום כולו, כי במהירות לזהות מועמדי חיסון בצורה של חלבונים שלמים או אפיטופים פפטיד המופקים מproteomes הפתוגן. בעוד טכנולוגיה שמאפשרת את זה הוא עיצוב מחדש גילוי ופיתוח של חיסוני מגן, הוא מציג אתגר חדש בצורה של רשימות גדולות intractably של מועמדי חיסון immunogenic. מבחני מחייבים תפוקה גבוהה פפטיד-MHC II יכולים להדריך את בחירת epitope ידי כימותי זיקה מחייבת פפטיד ומחייב הפקרות בין אללים MHC II מרובים. כמו עם deimmunization חלבון, שיטות ניסיוניות כאלה סופו של דבר נדרשו כדי לאמת את הניבוי חישובית של מוביל חיסון מבטיח.
הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לפורמט 384 גם הוא תאר. הפרוטוקול הוא למקבל ביותר ומפחית את העלויות מגיב על ידי 75% בהשוואה שלתואר קודם לכן 96 היטב פורמטי צלחת 1,3-5. שימוש של נוזלים אחתד טיפול ברובוט, שיטה זו מאפשרת לחוקר אחד לנתח בקלות כ תשעים פפטידים מבחן בשלושה עותקים על פני טווח של שמונה ריכוזים וארבעה סוגי MHC II אלל בפחות מ 48 שעות. מאמר זה מתאר את ההתקנה של צלחת 384 גם ELISA אחד לניתוח של שבעה פפטידים ניסיוניים נגד אחד אלל MHC II, אבל מחשבוני גיליון להפיץ מסופקים כחומר משלים כדי להתרחב בקלות את הניסוי לכל מספר של פפטידים ו / או MHC רצויים השני מולקולות.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biotherapeutics הקימו את עצמם כפינה של רפואה המודרנית, המייצג את ארבעה מחמש התרופות הנמכרות ביותר בשנת 2012 32. Biopharmaceutics המגזר הראה צמיחה מתמשכת במשך כמה שנות 6, והפיתוח המתמשך של סוכני רומן, כמו גם את הופעתה של biosimilars הרחיב צינורות ביולוגיות. במבט לעתיד, הערכה ומקלי i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01-GM-098,977 וR21-AI-098,122 לCBK וחבית. RSS נתמך בחלקו על ידי לוס קרן מלגה ובחלקו על ידי מלגת תייר חדשנות תכנית מבית הספר תאייר להנדסה.
Materials
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Sigma | 221732 | |
| Citric Acid | Sigma | C1901 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Sigma | S7907 | |
| Trizma HCl | OmniPur | 9310 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| 100% DMSO | Sigma | D8418 | |
| Octyl-β-D-Glucopyranaside | Fischer | 29836-26-8 | |
| Pefa Bloc SCF | Roche | 1158591600 | |
| Dulbecco’s 10X Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14200-166 | |
| DELFIA Assay Buffer | Perkin Elmer | 4002-0010 | |
| DELFIA Enhancement Buffer | Perkin Elmer | 4001-0010 | |
| Europium Labelled Streptavidin | Perkin Elmer | 1244-360 | |
| L243 anti-HLA-DR antibody | Biolegend | 307602 | |
| Biotinylated tracer peptides | 21st Century Biochemicals | Custom Order | |
| Test peptides (1-4mg, 85% purity) | Genscript | Custom Order | |
| Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) | Benaroya Research Institute* | Custom Order | |
| 384-well white EIA/RIA plate | Thermo | 460372 | |
| Polypropylene 384-well plate | Costar | 3656 | |
| Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator | Axygen Asicentific | PCR-SP | |
| MilliQ Water | N/A | N/A | |
| Epimotion Liquid Handler (or similar) | Eppendorf | 5075 | |
| Select TS Plate Washer (or similar) | BioTek | 405 | |
| SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) | Molecular Devices | N/A | |
| *Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory | |||
Referências
- Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
- Raddrizzani, L., et al. Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires. J. Immunol. 159, 703-711 (1997).
- Osipovitch, D. C., et al. Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy. Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).
- Moise, L., et al. In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes. Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).
- Moise, L., et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).
- Aggarwal, S. R. What’s fueling the biotech engine-2011 to 2012. Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).
- Warmerdam, P. A. M., et al. Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling. Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).
- Jones, T. D., et al. Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).
- Harding, F. A., et al. A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy. Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).
- Mazor, R., et al. Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).
- Cantor, J. R., et al. Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).
- Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer. Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).
- Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. High throughput T epitope mapping and vaccine development. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720 (2010).
- Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
- Singh, H., Raghava, G. P. ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).
- Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding. Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).
- Wan, J., et al. SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides. BMC Bioinformatics. 7, 463 (2006).
- Bui, H. H., et al. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).
- Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8, 238 (2007).
- Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. NetMHCIIpan-2.0 – Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure. Immun. Res. 6, 9 (2010).
- De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification. Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).
- Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content. J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).
- Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins. J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).
- Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions. J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).
- Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins. BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).
- De Groot, A. S., Martin, W. Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).
- Wang, P., et al. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).
- Sette, A., Rappuoli, R. Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics. Immunity. 33, 530-541 (2010).
- Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines. Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).
- Sturniolo, T., et al. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).
- . Biologic drugs set to top 2012 sales. Nat. Med. 18, 636 (2012).
- Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology. Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).
- Jiang, W., Boder, E. T. High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).
- Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -. L. B., Buus, S. Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays. Immun. 5, 1-20 (2009).
