Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope
Summary
Biochemischen Assays mit rekombinanten menschlichen MHC-II-Moleküle können schnelle, quantitative Einsichten in immunogenes Epitop Identifizierung, Deletion oder Design zu schaffen. Hier wird ein Peptid-MHC-II-Bindungsassay auf 384-Well-Platten skaliert wird beschrieben. Diese kostengünstige Format ist auf den Gebieten der Protein-und Impfstoff Deimmunisierung Design und Entwicklung beweisen.
Abstract
Biochemischen Assays mit rekombinanten menschlichen MHC-II-Moleküle können schnelle, quantitative Einsichten in immunogenes Epitop Identifizierung, Deletion oder Design 1,2 bereitzustellen. Hier wird ein Peptid-MHC-II-Bindungsassay auf 384-Well-Format skaliert. Die abgespeckte Protokoll reduziert Reagenzienkosten um 75% und höheren Durchsatz als zuvor beschriebenen 96-Loch-Protokolle 1,3-5. Genauer gesagt, der experimentelle Aufbau ermöglicht robuste und reproduzierbare Analyse von bis zu 15 Peptide gegen einen MHC-II-Allel pro 384-Well-ELISA-Platte. Mit einem einzigen Liquid-Handling-Roboter ermöglicht diese Methode ein Forscher auf etwa neunzig Testpeptide in dreifacher Ausfertigung über einen Bereich von acht und vier Konzentrationen von MHC-II-Allel Arten in weniger als 48 Stunden zu analysieren. Andere arbeiten in den Bereichen Protein Deimmunisierung oder Impfstoff-Design und Entwicklung kann das Protokoll zu finden, die in die Erleichterung ihrer eigenen Arbeit zu sein. Insbesondere die Schritt-für-Schritt-Anweisungen und die visuellen FormatJupiters sollte damit andere Benutzer schnell und einfach diese Methodik zu etablieren in ihren eigenen Labors.
Introduction
Proteine sind die am schnellsten wachsende Klasse von Therapeutika 6 und die rasche Expansion der Biotherapeutika-Pipelines hat immer mehr Aufmerksamkeit auf die Herausforderungen, die mit der Entwicklung und Verwendung von Protein Drogen konzentriert. Eine einzigartige Betrachtung ergibt sich aus der Tatsache, daß in einem gesunden und funktionierenden Immunsystems, alle extrazellulären Proteine werden durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) abgetastet. Einmal durch APCs internalisiert wird ein Protein in kleine Peptidfragmente gespalten, und putativen immunogenen Segmente werden in die Nut des Klasse-II-Haupthistokompatibilitätskomplex-Proteine (MHC II) geladen. Die Peptid-MHC-II-Komplexe werden dann auf der Oberfläche von APC angezeigt und wahre immunogene Peptide, genannt T-Zell-Epitope bilden ternären II-MHC-Peptid-T-Zell-Rezeptor-Komplexe mit verwandten CD4 T-Zell-Oberflächenrezeptoren 7. Diese kritische Ereignis molekularen Erkennung löst eine komplexe Signalkaskade, die in T-Zell-Aktivierung führt, die Freisetzung von Zytokins, CD4-T-Zell-vermittelten B-Zell-Reifung und letztlich die Produktion von zirkulierenden IgG-Antikörper, die zu binden und deaktivieren Sie das säumige exogene Protein. So könnte immunogene Proteine durch die Identifizierung Bestand T-Zell-Epitopen und mutiert Schlüsselreste für MHC-II-Komplexbildung verantwortlich deimmunized werden. Es trägt jedoch in Kenntnis, dass T-Zell-Epitope können zahlreiche und breit während immunogene Proteine verteilt sein, und die Mehrheit der Epitop-Löschen Mutationen wahrscheinlich ein unbeabsichtigter Verlust der Proteinfunktion oder Stabilität verursachen. Daher deimmunized Engineering Biotherapien kann eine komplexe und technisch anspruchsvolle Ziel sein, aber es gibt mehrere Beispiele von erfolgreichen T-Zell-Epitop-Deletion Projekte 3,5,8-12. Anders als Pfropfen-basierten "Humanisierung", die weitgehend auf Antikörper-Therapeutika eingeschränkt ist, kann Epitop Löschung im Wesentlichen jedes Zielprotein unabhängig von der Sequenz, Struktur, Funktion angewendet werden, oder die Verfügbarkeit von homologouns Menschen Gerüste. Der erste Schritt zur Umsetzung eines solchen Ansatzes ist die Identifizierung von Schlüssel Peptid-Epitope innerhalb der Zielproteinsequenz eingebettet.
Hoher Durchsatz biochemischen Assays unter Verwendung von synthetischen Peptiden und rekombinanten humanen MHC-II-Moleküle kann eine schnelle vorläufige Einblicke in Epitop-Erkennung und Eingrenzung 1,3-5 bieten. Diese ELISA-Assays kann eine starke Ergänzung zu anderen Protein / Impfstoff-Design-und Entwicklungstools können. Zum Beispiel, eine gut etablierte experimentelle Ansatz zur Epitop-Mapping setzt auf Zeit, Arbeit, ressourcenintensiv und Ex-vivo-Zellproliferationsassays 15. Kurz gesagt, wird die Primärsequenz eines Zielproteins zunächst in einer Gruppe von überlappenden Peptiden unterteilt häufig überlappen 15-mere mit 12 Resten zwischen benachbarten Peptiden. Das Peptid chemisch synthetisiert wird Platte und der Immunogenität jedes Peptid in einer von mehreren verschiedenen Immunoassays, die Umfangs bloo beschäftigen getestetd mononuklearen Zellen (PBMC) aus menschlichen Spendern isoliert 13,14. Um mehr Vertrauen in die Ergebnisse liefern, Peptide werden typischerweise in Replikat mit PBMC von 50 oder mehr verschiedenen Spendern getestet. In Fällen, in denen Deimmunisierung ist das ultimative Ziel ist die Arbeit noch durch die Notwendigkeit, zusätzliche Platten von mutierten Peptide produzieren und testen Sie die neuen Peptid-Panels in PBMC-Tests vor der Einführung deimmunizing keine Mutationen in das Protein voller Länge für spätere Funktionsanalyse 10 verstärkt. Während diese zellulären Assays bleibt der Goldstandard für die Bewertung der immunogenen Potential in menschlichen Patienten, kann die Effizienz eines solchen erschöpfend Ansatz Vorfilterung putativen immunogenen Epitopen unter Verwendung eines schnellen und hohen Durchsatz MHC-II-Peptid-Bindungstest verbessert werden.
Ebenso können biochemische Peptid-MHC-II-Bindungsassays mit prädiktiven in silico-Methoden kombiniert werden, um radikal zu beschleunigen, die das Epitop Identifikationsprozess.Es gibt eine Vielzahl von Computerwerkzeuge für die T-Zell-Epitop-Vorhersage Beispiele schließen ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, ARB 19, SMM ausrichten 20, 21 NetMHCIIpan sowie proprietäre Tools wie EpiMatrix von EpiVax 22. Ebenso haben Epitop Prädiktoren vor kurzem mit anderen Bioinformatik und Molekularmodellierungswerkzeuge, integrierte Protein Deimmunisierung Algorithmen entwickelt, um das Risiko, dass deimmunizing Mutationen könnten Protein-Struktur und Funktion stören 23-26 mildern ergeben kombiniert. Während mehrere Epitop Prädiktoren haben sich einigermaßen genau zu sein 27,28, Rechenergebnisse immer erfordern experimentelle Validierung. Schnelle, hohen Durchsatz und kosteneffektive experimentellen Methoden am besten geeignet sind als Vorfilter für die in silico-Epitop-Vorhersagen.
In ähnlicher Weise kann Epitop Prädiktoren Antigen-Auswahl für Rückwärts vaccinolo fahrengy 29,30. Beispielsweise haben Fortschritte in der Bioinformatik gesamte Genom Bildschirme schnell in Form von ganzen Proteinen oder Peptid-Epitope aus Pathogen Proteome extrahiert identifizieren Impfstoffkandidaten ergab. Während diese grundlegende Technologie ist Neugestaltung der Entdeckung und Entwicklung von Schutz Impfstoffe, stellt es eine neue Herausforderung in Form von widerspenstig große Listen von immunogenen Impfstoff-Kandidaten. Hochdurchsatz-Peptid-MHC-II-Bindungsassays können Epitop-Auswahl führen durch die Quantifizierung Peptid-Bindungsaffinität und Bindungs Promiskuität unter mehreren MHC-II-Allele. Wie bei Protein Deimmunisierung werden solche experimentellen Methoden erforderlich, um letztlich computergestützten Vorhersage von vielversprechenden Impfstoff führt zu validieren.
Hier wird ein Peptid-MHC-II-Bindungsassay auf 384-Well-Format skaliert wird beschrieben. Das Protokoll ist sehr parallelisierten und reduziert Reagenzienkosten um 75% im Vergleich zum zuvor beschriebenen 96-Well-Plattenformate 1,3-5. Mit einem einzigen Liquidationd Handling-Roboter ermöglicht diese Methode ein Forscher leicht über einen Bereich von acht und vier Konzentrationen von MHC-II-Allel Arten in weniger als 48 Stunden zu analysieren etwa neunzig Testpeptide in dreifacher Ausfertigung. Dieser Artikel beschreibt die Einrichtung eines 384-Well-ELISA-Platte für die Analyse von sieben experimentellen Peptide gegen einen MHC-II-Allel, aber Tabellenkalkulation Taschenrechner werden als ergänzendes Material zur Verfügung gestellt, um so leicht zu skalieren das Experiment auf eine beliebige Anzahl von gewünschten Peptide und / oder MHC II-Molekülen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biotherapeutics haben sich als Eckpfeiler der modernen Medizin gegründet, repräsentiert vier der fünf meistverkauften Medikamente im Jahr 2012 32. Die Biopharmazie-Sektor hat ein nachhaltiges Wachstum für mehrere Jahre 6 gezeigt, und der laufenden Entwicklung neuer Wirkstoffe sowie die Entstehung von Biosimilars hat biopharmazeutischen Pipelines ausgebaut. Blick in die Zukunft, Bewertung und Minderung der Immunogenität von Proteintherapeutika wird ein integraler Bestandteil der frühen Phase B…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse R01-GM-098977 und R21-AI-098122 zu CBK und KEG unterstützt. RSS wurde zum Teil durch eine Luce Foundation Fellowship und zum Teil durch eine Thayer Innovation Program-Stipendium der Thayer School of Engineering unterstützt.
Materials
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Sigma | 221732 | |
| Citric Acid | Sigma | C1901 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Sigma | S7907 | |
| Trizma HCl | OmniPur | 9310 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| 100% DMSO | Sigma | D8418 | |
| Octyl-β-D-Glucopyranaside | Fischer | 29836-26-8 | |
| Pefa Bloc SCF | Roche | 1158591600 | |
| Dulbecco’s 10X Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14200-166 | |
| DELFIA Assay Buffer | Perkin Elmer | 4002-0010 | |
| DELFIA Enhancement Buffer | Perkin Elmer | 4001-0010 | |
| Europium Labelled Streptavidin | Perkin Elmer | 1244-360 | |
| L243 anti-HLA-DR antibody | Biolegend | 307602 | |
| Biotinylated tracer peptides | 21st Century Biochemicals | Custom Order | |
| Test peptides (1-4mg, 85% purity) | Genscript | Custom Order | |
| Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) | Benaroya Research Institute* | Custom Order | |
| 384-well white EIA/RIA plate | Thermo | 460372 | |
| Polypropylene 384-well plate | Costar | 3656 | |
| Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator | Axygen Asicentific | PCR-SP | |
| MilliQ Water | N/A | N/A | |
| Epimotion Liquid Handler (or similar) | Eppendorf | 5075 | |
| Select TS Plate Washer (or similar) | BioTek | 405 | |
| SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) | Molecular Devices | N/A | |
| *Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory | |||
Referências
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