Консенсус мозга, полученных Белок, Добыча протокол по изучению человека и мыши мозга Proteome использованием как 2D-Dige и мини 2DE Иммуноблоттинг

Summary

Протокол добыча общего белка с использованием мочевины / тиомочевины / SDS буфера для человека и мышей мозговой ткани позволяет Идентификация белков по 2D-Dige и их последующей характеристики по мини 2DE иммуноблоттинга. Этот метод позволяет получить более воспроизводимые и надежные результаты от человека биопсии и экспериментальных моделей.

Abstract

Электрофорез Двумерная гель (2DE) является мощным инструментом, чтобы раскрыть Proteome изменения потенциально связанные с различными физиологическими или патологическими состояниями. В основном, этот метод основан на разделении белков в соответствии с их изоэлектрической точке на первой стадии, а во-вторых в соответствии с их молекул рной массы методом SDS электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). В этом докладе оптимизирован протокол пробоподготовки для небольшого количества человеческой посмертного и мышь мозговой ткани описывается. Этот метод позволяет выполнять как двумерный электрофорез разница флуоресценции геля (2D-Dige) и мини-2DE иммуноблоттинга. Сочетание этих подходов позволяет не только найти новые белки и / или модификации белка в их экспрессии, благодаря его совместимости с массовой обнаружения спектрометрии, но и новый взгляд на проверки маркеров. Таким образом, мини-2DE сочетании с западными блоттинга разрешений для идентификации и проверки постЦионные модификации, белки катаболизм и обеспечивает качественное сравнение между различными условий и / или лечения. В данном случае мы предлагаем способ для изучения компонентов белковых агрегатов, найденные в БА и деменцию с тельцами Леви, такие как бета-амилоида пептида и альфа-синуклеина. Наш способ может быть адаптирован таким образом, для анализа протеома и нерастворимые белки извлечь из мозговой ткани и мышей моделей человека слишком. Параллельно, он может дать полезную информацию для изучения молекулярных и клеточных путей, участвующих в нейродегенеративных заболеваний, а также потенциальных биомаркеров новых и терапевтических целей.

Introduction

Психические и неврологические расстройства составляют 13% от глобального бремени болезней, новые проблемы как патофизиологических механизмов, факторов риска и продромальными биомаркеров должны быть изучены ^1. В соответствии с этой целью, протеомики исследования человеческого мозга стали незаменимыми, чтобы раскрыть молекулярные пути, участвующие в таких процессах, как память, поведение, эмоции и нейронной пластичности, например, не только для физиологического, но и для патологических состояний. Таким образом, использование животных моделей и, в частности трансгенные мыши, приносит широкий спектр возможностей, чтобы имитировать этиологии нейродегенеративных расстройств человека ^2.

Протеомики подходы в настоящее время доступны для того, чтобы выполнить эти новые перспективы в области неврологии. Двухмерным электрофорезом в геле (2DE) является мощным и, вероятно, простой метод, который позволяет сравнивать протеом широкого круга образцов. Кроме того, это такжемощный метод для выделения белка из сложной смеси с целью выявления и дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии. Этот метод по существу состоит в две последовательные стадии: 1) разделения белков в зависимости от их изоэлектрической точки (PI) по изоэлектрофокусирование (IEF). Точнее, электрический потенциал создают на акриламидных полос immobiline среди градиентом рН, а затем белки будут мигрировать и сосредоточиться на определенной интерфейса в зависимости от их глобальной сети бесплатно. 2) изоэлектрически ориентированные белки денатурируют и отрицательно заряженные добавлением додецилсульфата натрия (SDS), в результате чего белки в их первой структуры разделены в зависимости от их кажущейся молекулярной массой (Mw) в ДСН-ПААГ ^3. Эти два различных свойства позволяют нам решать двойное значение пойти дальше в изучении протеома. С одной стороны, этот подход дает возможность выполнить количественный анализ с использованием метода минимальные красители 2D-Dige, а с другой стороны КАЧЕСТВЕННЫХэ анализ мини-2DE соединен с вестерн-блоттинга.

Количественный анализ по 2D-Dige дарует экспрессии белка меняется во всем образца протеома. Вкратце, пробы помечены трех цианинов (CY2, Cy3 и Cy5), излучающих на трех различных длин волн (синий, зеленый и красный). Эти минимальные Fluor красители, содержащие N-гидрокси группу сукцинимидил эфира реагирует с ε-аминогруппой лизина остатков белков в результате чего ковалентных амидных связей ^4. Остатков лизина помечены только между 1-3% и таким образом предотвращая несколько ярлыков дополнительно за белка и серьезные изменения суммарного заряда ^{5, 6.} Су3 и Су5 часто используется для обозначения двух независимых выборок в то время как Су2 теги сочетание равной пропорции образцов для сравнения. Два основных преимущества, что все меченые образцы смешиваются и МЭФ и SDS-PAGE осуществляются в одном геле сразу для каждого шага, избегая среди вариабельность экспериментов из-за Гели сравнение. Кроме того, он представляет высокий порог обнаружения составляет около 1 femtomole белка ^7. Гели сканируются и 2D программное обеспечение сравнивает 2D флуоресцентные изображения гель, где Cy2 служит в качестве внутреннего стандарта, позволяющего для идентификации статистических различий между местами для их идентификации задней методом масс-спектрометрии. Программное обеспечение 2D анализ с использованием внутреннего стандарта достигает быстрое обнаружение менее 10% различий между образцами с более чем 95% от статистической достоверности ^8.

Качественный анализ по мини-2DE является важным шагом для белка характеристики. Принцип такой же, как было описано ранее для пи и разделения МВт, но в этом случае белки передаются из небольшого полиакриламидном геле с мембраной и иммуноблоттинга выполняется после этого. В то время как один электрофорез измерение гель обеспечивает изменения в экспрессии белка для одного или нескольких белковых эпитопов в зависимости от антитела, в ИНФОРМАЦИЯн мини-2DE наделяет двух дополнительных параметров. Во-первых, белковые isovariants изменяться в зависимости от ПИ, указывая, что посттрансляционные модификации может иметь место. Во-вторых, масса спектрометрия идентификация может свидетельствовать о возможных зимогенов и катаболических продуктов белков. Таким образом, изменения, наблюдаемые 2D-Dige, скорее всего, свидетельствует о механизмах, лежащих в основе изменений в глобальной профиль протеома. Трассы из иммуноблотах среди нескольких образцов за тот же белок эпитопной / с по мини-2DE может отражать кислотности изменения проливают свет на пост-трансляционных изменений немного, наблюдаемых или даже не monodimensional иммуноблотинга ^{9, 10.} Кроме того, этот анализ информирует о потенциальных сайтов расщепления из-за ведома ИП и МВт метаболических остатков ^11,12.

Сочетание этих двух методов обеспечивает дополнительный анализ протеомики. С одной стороны 2D-ПГЛП дает А типэ различий, позволяющих точное выделение полипептидов, экспрессия которых отличается. Эти различия состоят в основном в появления или исчезновения пятна или увеличения / уменьшения интенсивности данной одного программным обеспечением анализа флуоресцентных гелей. Тем не менее, эти наблюдения сами по себе вряд ли объяснить природу модификации наблюдается. По этим причинам, как только полипептид выделен и идентифицирован методом масс-спектрометрии, использование мини-2DE позволяет точно подтвердить 1) личность белка, выделенного и 2) характер разницы: изменение в уровне изовариантным / изоформы Выражение, пост-трансляционные модификации и процессы расщепления например. Тем не менее, необходимо разработать начальный лизирующего буфера и совместимый с 2D-Dige и с мини-2DE того, чтобы ограничить возможные дисперсий в результате использования экстракции протоколов, которые очень различны.

В настоящей статье мы деописано адаптированный протокол для подготовки, добычи и выполнения 2D-Dige и методов мини-2DE для белков мозга, поступающих из человека и мыши ткани.

Protocol

1. Гомогенизация и общего белка Добыча человека и мыши, ткани головного мозга Мозговая ткань гомогенизации. Однородный ткани головного мозга 10% (вес / объем) в 8 М мочевине, 2 М тиомочевины и 1% вес / объем SDS буфера (ОТС) с использованием Поттер стекло (для образцов человека) или гомоген?…

Representative Results

Протеомика на ткани головного мозга остается сложной, так как существует идеального буфер не существует, чтобы восстановить 100% белков, особенно ассоциированных с мембранами или цитоскелета белки. Первый набор экспериментов были сосредоточены на поиске подходящего буфера для лизиса, …

Discussion

Открывая патологические изменения экспрессии белков, поиск биомаркеров и модуляция потенциальных путей фармакологических мишеней являются одними из целей neuroproteomics подходы ^30. На фоне развивающихся инструментов, поле 2DE добавляет многообещающее ожидаемый. Тем не менее, консенсу?…

Materials

CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval/size
IPG Buffer, pH X-X	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval desired
AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1	GE Healtcare	551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l	GE Healtcare	17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92	Plastic box to make the passive rehydration
MILLEX GS Filter	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)	Bio-Rad		Reference in function of the MW to separate
IPGphor III Isoelectric Focusing Unit	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix Large Electrophoresis System	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm	Gel Company	P2D1.5