Экс естественных Культура мышиных эмбриональных Внешний Live-визуализации меланобластов миграции
Summary
Опишем вскрытие и Экс Vivo культуры мышиных эмбриональных кожи. Система культура содержит воздух-жидкость по всей поверхности ткани и позволяет изображений на инвертированный микроскоп. Меланобластов, составной частью развивающегося кожи, которые помечены флуоресцентно позволяя их поведение, которые должны соблюдаться с помощью конфокальной микроскопии.
Abstract
Меланобластов являются нервного гребня получены предшественники меланоцитов; клетки, ответственные за производство пигмента в коже и волосах. Меланобластов мигрируют через эпидермис зародыша, где они впоследствии колонизировать развития волосяных фолликулов 1,2. Нейронной миграции гребень клетка широко изучены в лабораторных, а в естественных условиях методов по-прежнему не очень хорошо развита, особенно в системах млекопитающих. Одним из вариантов является использование Экс Vivo органотипической культуры 3-6. Культура мышиных эмбриональных кожи требует поддержания воздушно-жидкостной интерфейса (ALI) по всей поверхности ткани 3,6. Высокое разрешение проживанию визуализации мышиных эмбриональных кожи был затруднен отсутствием хороший метод, который не только поддерживает этот ALI но и позволяет культура для получения обратной матрицы и поэтому совместим с коротким рабочим расстоянием объективов и наиболее конфокальной микроскопии. В этой статье описываются недавние улучшения в метод, который использует газ мембрану, чтобы преодолеть эти проблемы и позволяет с высоким разрешением конфокальной микроскопии эмбрионального кожи в Экс Vivo культуры 6. При использовании меланобластов конкретных Cre-рекомбиназы выражающее линию мыши в сочетании с репортером линии R26YFPR мы можем флюоресцентно маркировать население меланобластов в этих культурах кожи. Методика позволяет живой визуализации меланобластов и наблюдение за их поведением и взаимодействием с ткани, в которой они развиваются. Представитель результаты включены для демонстрации возможности жить-изображения 6 культур в параллель.
Introduction
Традиционно в зачаточном состоянии кожа была культивировали рассечением из эмбриона мыши и монтажа на поликарбонатной Nuclepore мембраны. Затем мембрану плавали на культуральной среде, тем самым сохраняя воздух-жидкость по всей поверхности ткани развивающегося 3,4. Этот метод был использован для анализа поведения меланобластов путем фиксации ткани и оценке меланобластов распределение с использованием β-галактозидазы в качестве маркера 7. Мы разработали метод, который позволяет жить-визуализация флуоресцентно меченных меланобластов в Экс Vivo культуры кожи 6. Здесь мы опишем метод в деталях от вскрытия, в установке, жить визуализации конфокальной и включают некоторые недавние улучшения.
Меланобласты являются эмбриональными предшественниками меланоцитов клетки, которые продуцируют пигмент в волосы и кожу. Меланобластов возникают в нервного гребня, прилегающей к нервной трубки около эмбриональный день 9 (E9) в развивающихся мыши еmbryo. Впоследствии они мигрируют вдоль дорсолатеральной пути между эктодермой и развивающихся сомитах. В E12.5 они двигаются от дермы в эпидермис, где они размножаются и продолжают их миграции. Первичный волосяной фолликул картина начинает формироваться в эпидермисе на E14.5 и E15.5 меланобластов которые локализации этих фолликулов. Для обзора развития меланоцит / меланоцитов см. Томас & Эриксон (2008) 1. Для того, чтобы маркировать население меланобластов мы объединили Тир :: CREB животных, которые выражают Cre-рекомбиназу, приводимый в действие мышь промотора тирозиназы 8 с R26YFPR животных, которые выражают желтый флуоресцентный белок (YFP) условно с Rosa26 локуса 9.
Мы опишем метод культуры эмбриональных кожи и захвата изображений с помощью перевернутой конфокальной микроскопии. Она приспособлена форма оригинальный метод описан в Морт и соавт. (2010) 6. Настоящийметод позволяет изображений в формате 6-луночный и удаляет зависимость от Nuclepore мембран и на Матригель для поддержки культуры. Вместо этого с помощью небольшого блока 1% агарозы, чтобы стабилизировать эмбриональных кожу. Снятие зависимость от матригеле особенно важно в ситуациях, когда реакция эмбриональной кожи к растворимых факторов роста находится в центре внимания исследования. Наш оригинальный метод уже использовался для получения новому взглянуть на развитие меланобластов 10-13, и мы ожидаем, что улучшения мы описываем здесь сделает его более мощным в качестве экспериментальной методики особенно там, где несколько параллельных культур является обязательным требованием.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы опишем метод для культуры эмбриональных кожи, которая особенностью поддаются визуализации жить-клеток на перевернутых конфокальной микроскопии. Способ включает в себя недавние улучшения, которые позволяют 6 культур для включения в образ параллельно и удаляет зависимость от матри?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке основного финансирования со стороны Совета по медицинским исследованиям. Мы благодарны Крейг Николь для подготовки технических чертежей. Мы благодарны Мэтью Пирсон и Павла Перри за их поддержку изображений.
Materials
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
Referências
- Thomas, A. J., Erickson, C. A. The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest. Pigment Cell & Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).
- Mayer, T. C. The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos. Biologia do Desenvolvimento. 34 (1), 39-46 (1973).
- Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis. Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).
- Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin. Biologia do Desenvolvimento. 189 (1), 22-32 (1997).
- Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies. Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).
- Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).
- Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles. Biologia do Desenvolvimento. 225 (2), 424-436 (2000).
- Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage. Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).
- Li, A., et al. Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod. Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).
- Li, A., et al. Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism. The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).
- Schachtner, H., et al. Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo. European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).
- Ma, Y., et al. Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation. Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).
