Стратегия для чувствительной, крупномасштабного Количественные Metabolomics
Summary
Метаболита профилирования был ценным активом в изучении обмена веществ в норме и патологии. Используя обычный поэтапное жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрии высокого разрешения с переключением полярности и быстрым рабочим циклом, мы опишем протокол для анализа полярный метаболический состав биологического материала с высокой чувствительностью, точностью и разрешением.
Abstract
Метаболита профилирования был ценным активом в изучении обмена веществ в норме и патологии. Тем не менее, современные платформы имеют различные лимитирующие факторы, такие как трудоемких образцов препаратов, низких пределов обнаружения, медленных скоростях сканирования, интенсивной оптимизации метода для каждого метаболита, и возможность измерения как положительно, так и отрицательно заряженных ионов в отдельных экспериментах. Таким образом, роман протокол метаболомика могли продвинуться Метаболомика исследования. Амид основе гидрофильные хроматографии позволяет полярный анализ метаболита без какой-либо химической производных. Высокое разрешение MS помощью Q-Exactive (QE-MS) улучшилась ионной оптики, увеличить скорость сканирования (256 мс при разрешении 70000), и имеет возможность проведения положительный / отрицательный переключение. Использование холодного стратегию извлечения метанола, и муфта столбец амидной с QE-МС позволяет надежное обнаружение 168 целевых полярных метаболитов и тысячами дополнительных особенностей одновременно. Датобработка осуществляется с помощью коммерчески доступного программного обеспечения в весьма эффективным способом, и неизвестные характеристики, извлеченные из масс-спектров, может быть получен в базах данных.
Introduction
Метаболомика, определенные в качестве эксперимента, который измеряет несколько метаболитов одновременно, был в районе интенсивных интерес. Метаболомика обеспечивает прямое считывание молекулярной физиологии и обеспечила понимание развития и заболевания, такие как рак 1-4. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) являются одними из наиболее часто используемых инструментов 5-9. ЯМР, особенно был использован для потока экспериментов с тяжелым изотопом меченых соединений, таких как 13 C меченых метаболитов, являются ЯМР-активных 10,11. Однако, эта стратегия требует относительно высокой чистоты образца и большое количество образцов, что ограничивает ее применение в метаболомики. Между тем, данные, полученные от ЯМР необходим интенсивный анализ и соединение назначение сложных спектров ЯМР трудно. ГХ-МС широко используется для полярных метаболитов и липидов исследований, но она требует летучих compounспуск и поэтому часто дериватизация метаболитов, которая иногда включает сложную химию, что может занять много времени и вводит экспериментальную шум.
Жидкостной хроматографии (LC), соединенный с тройной квадрупольный масс-спектрометрии использует первый квадрупольные для выбора неповрежденные родительские ионы, которые затем фрагментированные во втором квадруполе, а третий квадрупольного используется для выбора характерные фрагменты или ионы дочь. Этот метод, который записывает переход от родительских ионов к конкретным дочерних ионов, называется несколько мониторинг реакции (MRM). MRM является очень чувствительным, специфической и надежный метод как для малых молекул и белков количественного 12-15,21. Тем не менее, MRM имеет свои ограничения. Для достижения высокой специфичностью метод МРМ должна быть построена для каждого метаболита. Этот метод состоит в идентификации конкретного фрагмента и соответствующая оптимизированная энергию удара, которая требует предварительной знание Недвижимrties из метаболитов, представляющих интерес, таких, как информация химической структуры. Таким образом, с некоторыми исключениями, связанных с нейтральной потерю общих фрагментов, это не возможно идентифицировать неизвестные метаболиты с этим методом.
В последние годы, масс-спектрометрия высокого разрешения (HRMS) инструменты были освобождены, таких как LTQ-Orbitrap и Exactive серии, в QuanTof и TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS может обеспечить массы к заряду (m / z) интактных ионов с точностью в несколько частей на миллион. Поэтому HRMS инструмент работает путем обнаружения все ионы-предшественники (т.е. полный режим сканирования) могут получить прямой структурной информации из точной массы и, как следствие элементного состава анализируемого вещества, и эта информация может быть использована для выявления потенциальных метаболитов. В самом деле, вся информация о соединения могут быть получены с точной массе, до уровня структурных изомеров. Кроме того, полныйметод сканирования не требует предварительных знаний о метаболитов и не требует оптимизации метода. Более того, так как все ионы с м / з попадания в диапазоне сканирования могут быть проанализированы, HRMS имеет почти неограниченные возможности в плане количества метаболитов, которые могут быть количественно за один проход по сравнению с методом MRM. HRMS также сопоставимы с тройной квадруполь MRM в количественном мощности из-за короткого рабочего цикла, что приводит к сопоставимым количество точек данных, которые можно получить в полном MS сканирования. Поэтому HRMS предоставляет альтернативный подход для количественных метаболомики. Недавно улучшенная версия СУЛР называется Q-Exactive масс-спектрометрии (QE-МС) может работать под переключения между положительными и отрицательными мод с раз достаточно быстро циклов из одного метода, который расширяет диапазон обнаружения 19. Здесь мы опишем нашу стратегию метаболомики помощью QE-МС.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги для успешного профилирования метаболита в клетки, используя этот протокол, являются: 1) контроль за питательную среду и тщательного извлечение клеток; 2) доведение метод LC основана на MS установки метода чтобы у пассажиров было достаточно (обычно не менее 10) точек дан…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность Detlef Шумана, Дженнифер Саттон (Thermo Fisher Scientific) и Натаниэль Снайдер (Университет Пенсильвании) за ценные обсуждения на массового калибровки и обработки данных. Исследования сообщили в настоящей публикации при поддержке Национального института рака из Национального института здоровья в рамках премии Количество R00CA168997. Содержание является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здравоохранения.
Materials
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
Referências
- Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).
- Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).
- Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).
- Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292 (5518), 929-934 (2001).
- Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).
- Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).
- Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).
- Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).
- Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner–semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
- Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).
- Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).
- Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).
- Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).
- Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).
- Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).
- Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).
- Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).
- Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
- Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).
- Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
