神经元共培养与单细胞精度的制备
Summary
协议的单神经元微排列和水掩蔽生物材料涂层在芯片血浆图形描述。高度互联共培养可以使用最小的单元格输入做好准备。
Abstract
该Campenot室的微流控实施方案已经从神经科学界引起了极大的兴趣。这些互连的共培养平台，可用于调查的各种问题，跨越发育和功能性神经生物学感染和疾病传播。然而，传统的系统需要显著蜂窝输入（几千每隔室），不足用于研究低丰度细胞，如初级多巴胺能黑质，螺旋神经节，和果蝇黑腹果蝇的神经元，以及不切实际的高通量实验。密集的文化也备受本地纠缠，很少有副产物（<10％）互连的两种文化。在本文中简单的微流体和图案化的协议，描述了解决这些问题：（ⅰ）一种微流体的单神经元排列方法，以及（ii）水掩蔽方法为等离子体图案形成生物材料涂层来REGISTER神经元，促进车厢之间的产物。简约神经元共培养物制备了高水平（> 85％）intercompartment连接和可用于高通量神经生物学实验用单细胞精度。
Introduction
神经元组织是高度复杂的;即在空间中定义的图层和车厢，并用塑料连接通过细胞接触，特别是通过轴突和树突的副产物有序异质细胞的混合物。新技术必须赋予更大的自由度实验获得更深刻的见解和中央疾病，发展，健康功能绎机制。在Campenot室1,2和最近微细加工的实施例3,4可用于体外制备网络的神经元共培养物中以有选择地扰乱不同体细胞种群以及它们的轴突的副产物的能力。这些微流体装置已经例如被用于研究轴突变性和再生下述化学5,6或激光干切断6-8，τ病变9，病毒传播10,11，和mRNA定位于轴突4。
耳鼻喉科“>为了延长神经生物学家的覆盖范围，技术的发展需要编制简约神经元共培养。这使得神经网络的系统的单细胞和亚细胞精确调查的解缠结。为最小的细胞数目的要求打开来分析罕见的细胞类型，包括相关的帕金森氏病，从耳螺旋神经节，外周神经元的多巴胺能黑质细胞和干细胞的可能性。除此之外，蜂窝经济是相关的3R的主动权。使用这些微流体平台，大规模毒性帘或其他高吞吐量，数据丰富实验系列需要的动物的神经元现在可以考虑。
在本文中用于微流体装置的制作和使用的协议中说明。在原位 biomateri与微流控组合排列人的图案形成方法可用于使用最小细胞数目高度互连的神经元共培养物的登记。微流排列是基于差分流量的方法12-15，由此微陷阱被定位在流体回路（沿着与图1中的SEM图像示出）。路径0→1具有较低的流体阻力（R 2> R 1）运送到神经元的微结构化孔的线性阵列-入口到神经突向外生长频道。由一个单细胞的陷阱占用本地阻碍了流动转移的流线对邻国陷阱诱捕随后的细胞。在阵列中的陷阱完全占用切换流体比（R 1> R 2）的流线转移到蜿蜒路径（0→2），以产生动作的旁路模式以除去过量的神经元。
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图1微流控电路。 A）差分电阻流体回路单神经元排列，与侧翼由轴突生长的渠道互联文化室，B，双层隔离的神经元共培养阵列与半月板钉扎micropillars权证）的SEM图像。有了这个设计，三叉形神经元诱捕结构被用于促进神经突起的副产物的颤动。图与传奇再现英国皇家化学学会（RSC）的许可12。 点击这里查看大图。
微图案神经网络对平面衬底的制备可以很容易地实现（对于为例从我们的ES组，见Frimat 等 16海克等 17）。然而，在PDMS装置和与这些微米级的对准到微流体通道的要求包封生物活性材料图案构成了一个很大的技术挑战。在第3.1节中的协议为在芯片上，或原位制备的生物材料型态呈现。这些模式在漫长的文化时间表使神经元的登记和促进车厢之间的副产物。弯液面钉扎的微观结构是用来校准一个所谓水掩模与神经元的排列位点和神经突长出频道。水掩模保护粘附分子涂层中的等离子体处理，而暴露的表面被分解，以确定该生物材料的图案。此外，提供了用于细胞培养和对所需的不同共培养室的选择性治疗流体隔离协议。
ve_content“>该协议旨在利用软光刻技术的人性化原则聚的复制二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置18。同样， 在原位生物材料的图案很简单，利用蒸发和表面张力的现象，只有需要一种廉价的手持式等离子体源的微流体回路有效方案小区负载和隔室进行这些操作的特定处理简单地分配材料到正确的底部端口和从上述吸移的问题。以这种方式，它的目的是提供对神经生物学家自由地在自己的实验室准备和使用微流体装置。Protocol
Representative Results
Discussion
微流体组阵技术的先河，使精密单神经元的处理，建立简约的文化。再加上原位生物材料的构图方法，一种强大的方法，以使细胞形态与微结构，这些简约的文化有很高intercompartment连接水平与减少当地的纠缠。这些特征可以被用于室间传输的效率的研究，并且具有简单的设计修改必须分离单个轴突用于可视化和定量分析的潜力。例如，在下一代设计三叉戟结构可以与每个神经元长出1通道?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢乌尔里希Marggraf（ISAS）的SU-8制作和玛丽亚·贝克尔（ISAS）的扫描电镜成像。这项研究是由财政德意志研究联合会（DFG WE3737/3-1），一个Bundesministerium献给教化UND Forschung补助（BMBF 0101-31P6541）及的ministerium献给创新，Wissenschaft UND Forschung des Landes酒店北莱茵 – 威斯特法伦支持。海克Hardelauf感谢国际莱布尼茨研究生院“系统生物学实验室在一个芯片”的金融支持。
Materials
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| PDMS Elastosil RT 601 | Wacker | ||
| Coverslips | VWR | 630-1590 | 130-160 mm thick |
| 3 mm Biopsy Punches | Kai Medical | Handle with care – extremely sharp | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | S-50-HL | 1.65 mm ID; 3.35 mm OD |
| 1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix) | Braun | 6064204 | |
| 4-Way Tubing Connector | VWR or Fisher Scientific | ||
| Flow Regulator | Harvard Apparatus | 722645 | |
| 0.5 mm Pins | Dressmaking Departments | ||
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Stability in storage can be an issue |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| poly-lysine-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Inverted Fluorescent Microscope | |||
| Example Aspiration Pump | KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
| Hand Held Corona Discharge Device | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | May not comply with your country's safety standards |
| Femto Plasma Oven | Diener Electronic | ||
| Vacuum Dessicator or Centrifuge |
Referências
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