Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Ngoc-Duy Dinh; Ya-Yu Chiang; Heike Hardelauf; Sarah Waide; Dirk Janasek; Jonathan West

doi:10.3791/51389

JoVE Journal > Neuroscience

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Neurociência

सिंगल सेल प्रेसिजन साथ Neuronal सह संस्कृति की तैयारी

Published: May 20, 2014

doi:

10.3791/51389

Summary

एक न्यूरॉन microfluidic arraying और biomaterial कोटिंग्स में चिप प्लाज्मा patterning के लिए पानी मास्किंग के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित हैं. अत्यधिक परस्पर सह संस्कृतियों न्यूनतम सेल आदानों का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है.

Abstract

Campenot चैंबर के microfluidic embodiments तंत्रिका विज्ञान समुदाय से महान ब्याज को आकर्षित किया है. इन परस्पर सह संस्कृति प्लेटफार्मों संक्रमण और बीमारी प्रचार करने के लिए विकास और कार्यात्मक तंत्रिका जीव विज्ञान फैले, सवालों की एक किस्म की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, पारंपरिक प्रणालियों महत्वपूर्ण सेलुलर ऐसे प्राथमिक डोपामिनर्जिक substantia nigra, सर्पिल ganglia, और Drosophilia मेलानोगास्टर न्यूरॉन्स के रूप में कम बहुतायत कोशिकाओं के अध्ययन के लिए अपर्याप्त आदानों (डिब्बे प्रति कई हजारों),,, और उच्च throughput प्रयोग के लिए अव्यावहारिक आवश्यकता होती है. घने संस्कृतियों भी अत्यधिक स्थानीय स्तर पर दो संस्कृतियों के परस्पर कुछ outgrowths (<10%) के साथ, उलझ रहे हैं. (मैं) एक microfluidic न्यूरॉन विधि arraying, और प्लाज्मा patterning biomaterial कोटिंग्स regi करने के लिए (द्वितीय) एक पानी मास्किंग विधि: इस पत्र में सीधा microfluidic और patterning प्रोटोकॉल इन चुनौतियों से निपटने के जो वर्णन किया गया हैंन्यूरॉन्स ster और डिब्बों के बीच परिणाम को बढ़ावा देने. न्यूनतर neuronal सह संस्कृतियों उच्च स्तर (> 85%) intercompartment कनेक्टिविटी के साथ तैयार थे और एकल कक्ष परिशुद्धता के साथ उच्च throughput तंत्रिका जीव विज्ञान के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

Neuronal ऊतक अत्यधिक जटिल है; स्थानिक सेल संपर्क और विशेष रूप से अक्षतंतु और dendrite outgrowths के माध्यम से के माध्यम से परिभाषित परतों और डिब्बों के भीतर और प्लास्टिक कनेक्टिविटी के साथ आदेश दिया है कि एक विषम सेलुलर मिश्रण. नई तकनीक गहरी अंतर्दृष्टि और रोग, विकास, और स्वस्थ समारोह के लिए केंद्रीय सुलझाना तंत्र हासिल करने के लिए अधिक से अधिक प्रयोगात्मक स्वतंत्रता प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं. Campenot कक्ष ^1,2 और अधिक हाल ही में microfabricated embodiments ^3,4 चुनिंदा विभिन्न दैहिक आबादी उपद्रव और भी उनके neurite outgrowths करने की क्षमता के साथ नेटवर्क neuronal सह संस्कृतियों के पूर्व vivo तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ये microfluidic उपकरणों उदाहरण के लिए रासायनिक ^5,6 या लेजर axotomy ^6-8, tauopathy ^9, वायरल प्रसार ^10,11, और axons ⁴ में mRNA स्थानीयकरण निम्नलिखित अक्षतंतु अध: पतन और उत्थान अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

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Neurobiologists की पहुंच का विस्तार, तकनीकी विकास न्यूनतर neuronal सह संस्कृतियों तैयार करने के लिए आवश्यक हैं. इस एकल कक्ष और उप सेलुलर परिशुद्धता के साथ प्रणाली की जांच के लिए neuronal नेटवर्क के सुलझाव सक्षम बनाता है. न्यूनतम सेल नंबर के लिए आवश्यकता पार्किंसंस रोग, कान से सर्पिल ganglia, परिधीय न्यूरॉन्स के लिए प्रासंगिक डोपामिनर्जिक substantia nigra कोशिकाओं सहित दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं, विश्लेषण, और स्टेम कोशिकाओं के लिए संभावना को खोलता है. इस के अलावा, सेलुलर अर्थव्यवस्था 3Rs पहल के लिए प्रासंगिक है. इन microfluidic प्लेटफार्मों, बड़े पैमाने पर विषाक्तता स्क्रीन या अन्य उच्च throughput का प्रयोग, पशु न्यूरॉन्स की आवश्यकता डेटा अमीर प्रयोगात्मक श्रृंखला अब माना जा सकता है.

इस पत्र में एक microfluidic डिवाइस के निर्माण और उपयोग के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित हैं. सीटू biomateri में एक साथ संयोजन में microfluidic arrayingअल patterning विधि न्यूनतम सेल नंबर का उपयोग अत्यधिक परस्पर neuronal सह संस्कृतियों के पंजीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Microfluidic arraying एक अंतर प्रवाह दृष्टिकोण microstructured जाल एक fluidic सर्किट (चित्र 1 में SEM छवियों के साथ सचित्र) के भीतर तैनात हैं जिससे ^12-15, पर आधारित है. neurite परिणाम चैनलों को inlets – पथ 0 → 1 microstructured apertures की एक रैखिक सरणी के लिए न्यूरॉन्स के परिवहन के लिए कम fluidic प्रतिरोध (नि. _2> आर ₁₎ है. एक एकल कोशिका से जाल की रिहाइश स्थानीय स्तर पर पड़ोसी जाल में बाद में कोशिकाओं को फँसाने के लिए सुव्यवस्थित हटाने के प्रवाह में बाधा उत्पन्न करती. सरणी में जाल की पूरी अधिभोग अतिरिक्त न्यूरॉन्स को हटाने के लिए ऑपरेशन का एक बाईपास मोड के उत्पादन के लिए चक्करदार पथ (0 → 2) में सुव्यवस्थित हटाने की fluidic अनुपात (आर _1> आर ₂₎ स्विच.

चित्रा 1. Microfluidic सर्किट. Neurite परिणाम चैनलों से जुड़े संस्कृति कक्षों flanking साथ एक न्यूरॉन arraying के लिए ए) अंतर प्रतिरोध fluidic सर्किट,. बी, meniscus लगाए micropillars साथ bilayer बंटे न्यूरॉन सह संस्कृति सरणी के सी) SEM छवियों. इस डिजाइन के साथ, त्रिशूल के आकार का न्यूरॉन फँसाने संरचनाओं neurite outgrowths का स्फुरण बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया गया. चित्रा और रसायन विज्ञान की रॉयल सोसायटी (आरएससी) की अनुमति के साथ reproduced कथा ^12. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

तलीय substrates पर micropatterned neuronal नेटवर्क की तैयारी आसानी exampl के लिए (प्राप्त किया जा सकता है हमारे समूह से तों, Frimat एट अल. ¹⁶ और Heike एट अल. ¹⁷⁾ देखें. हालांकि, PDMS उपकरणों के भीतर और microfluidic चैनलों के लिए इनमें से सुक्ष्ममापी पैमाने संरेखण की आवश्यकता के साथ bioactive सामग्री पैटर्न encapsulating एक प्रमुख तकनीकी चुनौती बन गया है. खंड 3.1 में के लिए एक प्रोटोकॉल में चिप, या बगल में, biomaterial पैटर्न की तैयारी में प्रस्तुत किया है. इन नमूनों लंबा संस्कृति timescales दौरान न्यूरॉन पंजीकरण सक्षम और डिब्बों के बीच outgrowths को बढ़ावा देने. Meniscus-लगाए microstructures न्यूरॉन साइटों और neurite परिणाम चैनलों arraying साथ एक तथाकथित पानी मुखौटा संरेखित करने के लिए उपयोग किया जाता है. सतहों उजागर biomaterial स्वरूप को परिभाषित करने के लिए विघटित कर रहे हैं, जबकि पानी का मुखौटा, प्लाज्मा उपचार के दौरान आसंजन अणु कोटिंग्स की रक्षा करता है. इसके अलावा, प्रोटोकॉल सेल संस्कृति के लिए और विभिन्न सह संस्कृति डिब्बों के चुनिंदा उपचार के लिए आवश्यक fluidic अलगाव के लिए प्रदान की जाती हैं.

ve_content "> प्रोटोकॉल इसी तरह, सीटू biomaterial patterning में वाष्पीकरण और सतह तनाव घटना का शोषण, सीधा है. पाली की प्रतिकृति (dimethylsiloxane) (PDMS) microfluidic उपकरणों ¹⁸ के लिए नरम लिथोग्राफी के उपयोगकर्ता के अनुकूल सिद्धांतों का लाभ उठाने के लिए तैयार है, और कर रहे हैं केवल एक सस्ती हाथ से आयोजित प्लाज्मा स्रोत की आवश्यकता होती है. microfluidic सर्किट इन आपरेशनों बनाने को प्रभावी ढंग से कार्यक्रमों सेल लदान और डिब्बे विशिष्ट उपचार बस सही नीचे पोर्ट में सामग्री वितरण और ऊपर से aspirating की बात है. इस तरीके में, यह neurobiologists देने का इरादा है उनकी अपनी प्रयोगशालाओं में microfluidic उपकरणों को तैयार करने और उपयोग करने के लिए स्वतंत्रता.

Protocol

प्रोटोकॉल neuroscientists के लिए इरादा कर रहे हैं, और चित्रा 2 में संक्षेप हैं. जैसे यह व्यावसायिक या संस्थागत सुविधाओं को आउटसोर्स है PDMS प्रतिकृति के लिए इस्तेमाल किया SU-8 स्वामी की उस microfabrication की सलाह देते है. ?…

Representative Results

जल मास्किंग कारनामे तनाव सतह. हवा तरल इंटरफेस पर दबाव सहिष्णुता वक्रता [की त्रिज्या के साथ inversely तराजू , Microfluidic आयामों पर अत्यधिक स्थिर इंटरफेस का निर्माण किया. micropillars प्रभाव?…

Discussion

microfluidic arraying तकनीक न्यूनतर संस्कृतियों की स्थापना के लिए सटीक एक न्यूरॉन से निपटने में सक्षम बनाता है कि अपनी तरह का पहला है. Microfluidic संरचनाओं के साथ सेल पैटर्न के लिए पंक्ति में सीटू biomaterial patterning विधि में, ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखकों SEM इमेजिंग के लिए SU-8 निर्माण और मारिया बेकर (ISAs) के लिए Ulrich Marggraf (ISAs) के लिए आभारी हैं. अनुसंधान आर्थिक रूप से ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), एक Bundesministerium फर Bildung und Forschung अनुदान (BMBF 0101-31P6541) द्वारा और Ministerium फर अभिनव, Wissenschaft und Forschung डेस लैंडेस Nordrhein-Westfalen द्वारा समर्थित किया गया. Heike Hardelauf धन्यवाद अंतर्राष्ट्रीय लाइबनिट्स ग्रेजुएट स्कूल "सिस्टम्स बायोलॉजी लैब पर एक चिप" वित्तीय सहायता के लिए.

Materials

PDMS Sylgard 184	Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601	Wacker
Coverslips	VWR	630-1590	130-160 mm thick
3 mm Biopsy Punches	Kai Medical		Handle with care – extremely sharp
Tygon Tubing	Fisher Scientific	S-50-HL	1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix)	Braun	6064204
4-Way Tubing Connector	VWR or Fisher Scientific
Flow Regulator	Harvard Apparatus	722645
0.5 mm Pins	Dressmaking Departments
PLL-g-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)	Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407
poly-lysine-FITC	Sigma-Aldrich	P3069
poly-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957
fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006
laminin	Sigma-Aldrich	L2020
PBS	Sigma-Aldrich	P4417
Inverted Fluorescent Microscope
Example Aspiration Pump	KNF Neuberger, Laboport	N811KVP
Hand Held Corona Discharge Device	Leybold-Heraeus, USA	VP23	May not comply with your country's safety standards
Femto Plasma Oven	Diener Electronic
Vacuum Dessicator or Centrifuge

Referências

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Dinh, N., Chiang, Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).