Immunhistokjemiske og kalsium avbildningsmetoder i Wholemount Rat Retina

Summary

Immunhistokjemi protokoller brukes for å studere lokalisering av et bestemt protein i retina. Kalsium imaging teknikker er ansatt for å studere kalsium dynamikk i netthinnens ganglion celler og deres aksoner.

Abstract

I denne artikkelen beskriver vi verktøy, reagenser, og de praktiske tiltak som er nødvendig for: 1) vellykket utarbeidelse av wholemount netthinne for immunhistokjemi og, 2) kalsium bildebehandling for studiet av spenning gated kalsium kanal (VGCC) mediert kalsium signalisering i retinal ganglion-celler. Den kalsium avbildningsmetode vi beskrive omgår spørsmål om uspesifikk lasting av ford amacrine celler i ganglion celle laget.

Introduction

I retina-gangliecellene (RGCs) uttrykke L, N, P / Q-og T-type VGCC som bestemt ved farmakologisk blokkade av disse Komponentene av hele cellen Ca-kanalstrøm ^1,2. VGCC er transmembrane multimere proteiner som er involvert i senderen utgivelsen, gentranskripsjon, celleregulering og synaptisk plastisitet ^3,4,5. Funksjonelle VGCCs består av minst tre forskjellige klasser av subenheter: store, trans α _pt pore forming subenheter som etablerer kanalens biofysiske og farmakologiske egenskaper, først og fremst ekstracellulære hjelpe α ₂ δ subenheter og intracellulære β subenheter. De to sistnevnte skjema heteromeric komplekser med forskjellige α _pt subenheter og endre gating kinetikk og trafficking av kanalene til plasmamembranen ^seks.

Over de siste tiårene har mange teknikker blitt ansatt for å studere protein EXPREssion, slik som immunhistokjemi, enzym-bundet immunosorbent assay, western analyse og strømningscytometri. Disse teknikkene krever bruk av spesifikke antistoffer for detektering av et gitt protein av interesse, og gir kraftige verktøy for lokalisering og fordeling av spesifikke proteiner i forskjellige vev. Teknikker som brukes til å påvise og kvantifisere mRNA-ekspresjonsnivåene av et bestemt protein slik som Northern blot analyse, RT-PCR, sanntids kvantitativ RT-PCR, in situ hybridisering, cDNA mikromatriser og ribonuklease beskyttelsestest gir en alternativ tilnærming når antistoffer er ikke lett tilgjengelig, eller hvis uttrykk nivåer av et bestemt protein er lave ^7. Imidlertid er en begrensning på bruken av slike molekylære teknikker er den nødvendige identifisering av gensekvensen.

Å lokalisere proteiner i netthinnen, kan immunhistokjemi utføres på wholemount netthinne. På grunn av tilgjengeligheten av RGCs, den wholemountpreparatet gir en utmerket plattform for å studere lokalisering av spesifikke proteiner til RGC somata og deres aksoner.

I tillegg til deres lokalisering, kan enkelte funksjonelle egenskaper hos de VGCCs i RGCs demonstreres gjennom bruk av kalsium-avbildningsteknikker. Vi beskriver en kalsium bildebehandling protokoll for å selektivt merke RGCs med en kalsium indikator fargestoff å måle intracellulære kalsium dynamikk. Bidraget av forskjellige VGCCs til kalsium-signalet i forskjellige cellulære avdelinger kan isoleres ved bruk av subtype-spesifikke Ca-kanalblokkere.

Kanskje et av de mest fordelaktige aspekter av kalsium avbildningsteknikk som er beskrevet her er evnen til samtidig og uavhengig av hverandre opp fra flere RGCs og deres axoner. Selv om mange fysiologiske teknikker, for eksempel hele cellen patch clamp opptak, gi høy tidsoppløsning innspillinger av membran strømninger, det somatiske eller aksonal kilde these strømninger innspilte kan ikke bli diskriminert og opptak kan kun gjøres fra en enkelt nervecelle gangen. Multielectrode arrays (MEAS) er i stand til samtidig opptak av pigger fra mange celler, men kan heller ikke detektere eller diskriminere aktivering av, for eksempel, forskjellige subtyper av kalsiumkanaler. MEAS fortrinnsvis ta opp fra celler som er plassert i umiddelbar nærhet til en gitt elektrode ⁸ og ta opp fra celler som genererer store pigger ^ni. Optiske avbildningsmetoder gi en alternativ strategi for å aktivere samtidige og uavhengige opptak av hele populasjoner av celler som kan integreres med informasjon innhentet fra én celle microelectrode og patch clamp opptak og MEA opptak. Selv om kalsium-avbildningsteknikker som er beskrevet her ble anvendt for å studere de kalsium dynamikken i RGCs, kan patch clamp og MEAs også brukes i parallell for ytterligere å belyse de ioniske strømninger og tilsetnings egenskaper RGCs.

<pclass = "jove_content"> Siden ford amacrine celler utgjør ca 60% av nevronale befolkningen i ganglion celle laget i musen retina ^10, målet vårt var å bruke en laste teknikk som selektivt etiketter RGCs med en syntetisk kalsium indikator fargestoff i en wholemount forberedelse. Selv om syntetiske kalsium indikatorfargestoffer gir en utmerket plattform for studiet av den intracellulære kalsiumdynamikk, har sin utbredt bruk blitt hindret av manglende evne til å effektivt laste spesifikke populasjoner av nerveceller innenfor et gitt nettverk. Mange teknikker som bulklaste ¹¹ og elektroporering ^8,12 er blitt utført for å laste hele grupper av celler, men slike teknikker ikke diskriminerer mellom spesifikke celletyper. Genetisk kodede kalsium indikatorer gir evnen til selektivt å merke spesifikke populasjoner av celler, men slike metoder krever generering av transgene dyr ^13. Vår teknikk beskriver en method for selektivt å merke RGCs i wholemount preparat via synsnervestump injeksjon av en kalsiumindikator fargestoff.

Tatt sammen, de strukturelle og fysiologiske teknikker beskrevet i denne artikkelen gi en plattform for å studere lokalisering og bidrag av VGCCs til kalsium signal i RGCs og deres aksoner.

Protocol

Alle forsøkene ble utført i samsvar med retningslinjene for velferd forsøksdyr utstedt av US Public Health Service Politikk på Human Care og bruk av forsøksdyr og University of California-Los Angeles (UCLA) Forsøksdyrutvalget. Hann og hunn voksne Sprague-Dawley rotter (Charles River Labs, Wilmington, MA) i alderen 3-5 uker ble anvendt. 1. Animal og Vevpreparerina for Wholemount Retina og Immunohistokjemi Protocol Forbered følgende materialer og verktøy: En dissekere mikros…

Representative Results

Immunolabeling med spesifikke antistoffer gir en plattform for å studere lokalisering av spesielle proteiner av interesse i retina og kalsium avbildningsteknikk tillater studiet av bidraget av de VGCCs til kalsium dynamikk i retina-gangliecellene og deres axoner. Ved å bruke et antistoff mot ganglion celleprotein RBPMS (RNA-bindende protein med flere spleising) som selektivt etiketter RGCs 19, var vi i stand til å vise at Fluo-4 merking er begrenset til ganglion-celler …

Discussion

I denne artikkelen har vi beskrevet to ulike teknikker: 1) Immunhistokjemi å vise Fluo-4 lokalisering til ganglion celler i netthinnens wholemounts, og 2) Kalsium bildebehandling å analysere kalsium dynamikk i netthinnens ganglion celler og deres aksoner.

Immunhistokjemi hjelp wholemounts har blitt brukt til å avsløre lokalisering av proteiner i gnager retina ^20-23. Det er imidlertid noen begrensninger. Kvaliteten av fargings er sterkt avhengig av evnen til antistoffet til å …

Materials

Straight scissors	WPI	14124-G	dissecting tools
Straight Forceps	WPI	501985	dissecting tools
curved iris scissors	WPI	504487	dissecting tools
Cellulose filter paper	Millipore	HABP04700
Hibernate A	Invitrogen	A12475-01	Media
Vectashield	Vector	H-1000	Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium	Invitrogen	F-14200
Isoflurane	Abbott Laboratories	05260-05	anesthesia
Microscope slide	Fisher Scientific	22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope	Zeiss
Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens	Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular Probes	A-11034	Secondary antibody
RBPMS	ProSci, Poway, CA		A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).