Immunohistokemiska och Kalcium avbildningstekniker i Wholemount Rat Retina
Summary
Immunohistokemi-protokoll används för att studera lokalisering av ett specifikt protein i näthinnan. Kalcium avbildningstekniker används för att studera kalcium dynamiken i retinala ganglionceller och deras axoner.
Abstract
I detta dokument beskriver vi de verktyg, reagens och de praktiska åtgärder som behövs för: 1) utarbetandet av ett wholemount näthinnor för immunohistokemi och, 2) kalcium avbildning för studier av spänningen gated kalciumkanal (VGCC) förmedlad kalciumsignalering i retinal ganglionceller. Kalciumavbildningsmetod beskriver vi kringgår frågor om icke-specifik belastning av fördrivna amakrina celler i ganglion cellager.
Introduction
Näthinneganglieceller (RGC) uttrycker L-, N, P / Q och T-typ VGCC bestämd genom farmakologisk blockad av dessa komponenter i hela cellen Kalifornien Channel nuvarande 1,2. VGCC är transmulti proteiner som är involverade i transmittorfrisättning, gentranskription, cellreglering och synaptisk plasticitet 3,4,5. Funktionella VGCCs består av minst tre olika klasser av subenheter: stora, trans α 1 porbildande subenheter som etablerar kanalens biofysiska och farmakologiska egenskaper, främst extracellulärt hjälp α 2 δ subenheter och intracellulära β subenheter. De senare två formulär heteromera komplex med olika α 1 subenheter och ändra grind kinetik och trafficking av kanalerna till plasmamembranet 6.
Under de senaste decennierna har många tekniker använts för att studera protein Expression, såsom immunohistokemi, enzyme-linked immunosorbent assay, Western-analys och flödescytometri. Dessa tekniker kräver användning av specifika antikroppar för detektion av ett givet protein av intresse och ger kraftfulla verktyg för lokalisering och distribution av specifika proteiner i olika vävnader. Tekniker som används för att detektera och kvantifiera mRNA-expressionsnivåer av ett särskilt protein, såsom norra blot-analys, RT-PCR, realtids kvantitativ RT-PCR, in situ hybridisering, cDNA microarrays och ribonukleas skyddsanalys ger ett alternativt tillvägagångssätt när antikroppar inte är lätt tillgängliga eller om uttrycksnivåer av ett särskilt protein är låga 7. Emellertid en begränsning för användningen av sådana molekylära tekniker är den erforderliga identifieringen av gensekvensen.
För att lokalisera proteiner i näthinnan, kan immunohistokemi utföras på wholemount näthinnor. På grund av tillgängligheten till RGC, wholemountpreparatet ger en utmärkt plattform för att studera lokalisering av specifika proteiner till RGC somata och deras axoner.
Förutom deras lokalisering, kan vissa funktionella egenskaper hos de VGCCs i RGC demonstreras genom användning av kalciumavbildningstekniker. Vi beskriver en kalciumbildprotokoll för att selektivt märka RGC med en kalciumindikatorfärg för att mäta intracellulära kalcium dynamik. Bidraget från olika VGCCs till kalciumsignal i olika cellulära fack kan isoleras med användning av subtypspecifik Ca-kanalblockerare.
Kanske en av de mest positiva aspekterna av kalciumbildteknik som beskrivs här är förmågan att samtidigt och oberoende spela in från flera RGC och deras axoner. Även om många fysiologiska tekniker, såsom hel cell patch clamp inspelning, ger höga tidsupplösning inspelningar av membran strömmar, det somatiska eller axonal källa these strömmar inspelade kan inte diskrimineras och inspelningar kan endast göras från en enda neuron i taget. Multielektrodtyp arrayer (MEA) är samtidigt kunna spela in spikar från många celler, men kan varken upptäcka eller diskriminera aktivering av exempelvis olika undertyper av kalciumkanaler. MEAS preferentiellt spela in från celler som är lokaliserade i omedelbar närhet till en given elektrod 8 och spela in från celler som genererar stora spikar 9. Optiska avbildningsmetoder ger en alternativ strategi för att göra det möjligt för de samtidiga och oberoende inspelningar av hela populationer av celler som kan integreras med den information som erhållits från en enda cell mikroelektrod och patch clamp inspelning och MEA inspelning. Även om kalciumavbildningstekniker som beskrivs här användes för att studera kalcium dynamik RGC, kan patch klämma och MEA också användas parallellt för att ytterligare belysa jonströmmarnas och standardtillsatser egenskaper RGC.
<pclass = "jove_content"> Eftersom fördrivna amakrina celler för cirka 60% av den neuronala befolkningen i ganglion cellager i mus näthinnan 10, vårt mål var att använda en lastteknik som selektivt märker RGC med en syntetisk kalciumindikatorfärgämne i en wholemount beredning. Även syntetiska kalciumindikatorfärger ger en utmärkt plattform för att studera intracellulära kalcium dynamik, dess utbredda användningen hindrats av oförmågan att effektivt ladda specifika populationer av nervceller inom ett givet nät. Många tekniker såsom bulk lastning 11 och elektro 8,12 har utförts för att ladda hela samlingar av celler, men sådana tekniker inte diskriminera mellan specifika celltyper. Genetiskt kodade kalcium indikatorer ger möjlighet att selektivt märka specifika populationer av celler, men sådana metoder kräver generering av transgena djur 13. Vår teknik beskriver en metod att selektivt märka RGC i wholemount preparatet via synnerven stubbe injektion av en kalciumindikatorfärg.Sammantaget, de strukturella och fysiologiska metoder som beskrivs i denna artikel ger en plattform för att studera lokalisering och bidrag VGCCs till kalciumsignalen i RGC och deras axoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna artikel har vi beskrivit två olika tekniker: 1) Immunohistokemi att visa Fluo-4 lokalisering till ganglion celler i näthinnan wholemounts, och 2) Kalcium avbildning att analysera kalcium dynamik i näthinneganglieceller och deras axoner.
Immunohistokemi med användning wholemounts har använts för att avslöja lokaliseringen av proteiner i gnagare näthinnan 20-23. Men det finns några begränsningar. Kvaliteten på färgning är starkt beroende på förmågan hos antik…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr S. Stella och Helen Vuong för bidrag till kalcium imaging-protokollet. Vi tackar Dr K. Ark för filma intervjuscener. Vi tackar Dr Arlene Hirano för hennes synpunkter på manuskriptet. Denna forskning och utvecklingsprojekt genomfördes av författarna vid David Geffen School of Medicine vid UCLA och är möjligt genom ett kontrakt avtal som tilldelades och administreras av US Army Medical Research & Materielverk (USAMRMC) och telemedicin och Advanced Technology Research Center (TATRC), vid Fort Detrick, MD enligt Kontraktsnummer: W81XWH-10-2-0077. Stöd för dessa studier kom också från NIH EY04067 och VA Merit Review (NB). NCB är en VA Career Research Scientist.
Materials
| Straight scissors | WPI | 14124-G | dissecting tools |
| Straight Forceps | WPI | 501985 | dissecting tools |
| curved iris scissors | WPI | 504487 | dissecting tools |
| Cellulose filter paper | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | Vector | H-1000 | Mounting Media for Fluorescence |
| Fluo-4 pentapotassium | Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | anesthesia |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Zeiss LSM 5 Pascal microscope | Zeiss | ||
| Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular Probes | A-11034 | Secondary antibody |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA). |
Referências
- Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
- Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4. J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).
- Caterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).
- Berridge, M. J., et al. Calcium–a life and death signal. Nature. 395, 645-648 (1998).
- Berridge, M. J. Calcium microdomains Organization and function. Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits. Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Rottman, J. B. The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist. Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Segev, R., et al. Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch. Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).
- Jeon, C. J., et al. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).
- Blankenship, A. G., et al. Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves. Neuron. 62, 230-241 (2009).
- Daniels, B. A., Baldridge, W. H. d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells. J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).
- Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).
- Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina. J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).
- Hirano, A. A., et al. SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells. J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).
- Berridge, M. J., et al. Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).
- Dailey, M. E., et al. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).
- Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4. AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).
- Kwong, J. M. K., et al. RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).
- Pérez deSevilla Müller, L., et al. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).
- Pérez de Sevilla Müller, L., et al. Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).
- Raymond, I. D., et al. Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina. Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).
- Raymond, I. D., et al. A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones. J Physiol. 394, 501-527 (1987).
- Ascher, P., Nowak, L. The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture. J Physiol. 399, 247-266 (1988).
- Aizenman, E., et al. Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat. J Physiol. 396, 75-91 (1988).
- Taschenberger, H., et al. Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons. J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).
- Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
- Jakobs, T. C., et al. Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types. Mol Vis. 13, 933-948 (2007).
- Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells. J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).
- Margolis, D. J., et al. Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells. J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).
- Baldridge, W. H. Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina. J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).
- Hartwick, A. T., et al. Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging. J Neurochem. 94, 794-807 (2005).
- Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).
- Huberman, A. D., et al. Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells. Neuron. 59, 425-438 (2008).
- Kim, I. J., et al. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452, 478-482 (2008).
- Munch, T. A., et al. Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit. Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
