Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.
형광 현미경을 사용하여 생체 시료의 라이브 영상 샘플 초해 허용 광의 회절의 해상도 장벽을 극복 할 수있는 새로운 기술을 실질적으로 진보했다. 유도 방출 고갈 (STED) (예 : PALM, STORM 및 GDSIM 같은 기술 포함) 단일 분자 현지화 현미경 및 구조 조명 현미경 (SIM) – 초 해상 기술의 세 가지 주요 유형이 현재있다. STED와 단일 분자 현지화 기술이 해상도에서 가장 큰 증가를 보여 있지만, 그들은 이미지 수집의 증가 속도를 제공하는 느린왔다. 입체 SIM (3D-SIM)은 단일 분자 및 지역화 STED 둘 이상의 많은 장점을 제공 넓은 필드 형광 현미경 기법이다. 해상도를 허용, 커버 슬립에서 전형적인 횡 방향과 축 (110)의 해상도와 280 nm의 각각 최대 30 μm의 샘플링의 깊이와 개선전체 세포의 이미지. 상당히 광 독성 및 광표백을 줄이면서 것의 이미지 캡처 속도를 향상 기술의 최근의 진보 (고속 3D-SIM)은 초에서 발생 생물학적 과정의 빠른 포착을 허용한다. 여기서 우리는 이미지를 세포 분석 방법을 보여주는 형광 표지 된 cytokinetic FtsZ 단백질 및이 기술이 제공 할 수 있다는 특유의 정보 유형을 은닉 균체를 하나의 그러한 방법의 사용을 설명한다.
다른 이미징 기술의 수는 다양한 전자 및 광학 현미경 기술을 포함한 세균 공부 년간 사용되어왔다. 전자 현미경은 매우 높은 해상도를 제공하는 동안, 나노 미터까지, 진공 및 조영제의 사용에 대한 필요성이 매립 고정되고 시험편에이 기술을 제한하고있다. 아티팩트 인해 긴 샘플 준비 및 당업자가 샘플을 제조하고, 생성 된 이미지를 분석하고 해석하기 위해 필요로 도입 될 수있다. 광학 현미경은 간단한 시료 준비 및 전자 현미경에 비해 비교적 쉽게 다중 라벨의 적용 이점을 제공한다. 형광 단백질 및 염료 접합체보기, 형광 현미경으로 생균을 연구 할 수있는 능력을 사용하는 것도 가능하다. 카메라 검출 TECHN에서 세포 독성뿐만 아니라 진보 감소로 이어지는 형광 안정성과 형광 단백질 크기 / 구조 개선 포함ology, 넓은 필드와 공 촛점 이미징 시스템을 사용하여 형광 현미경은 크게 세포의 공간 역학에 대한 우리의 이해를 확대하고있다. 이러한 기술을 사용하여, 지난 20 년 동안 박테리아 세포에 대한 우리의 지식은 박테리아 세포 하나 내 구조와 단백질 조직의 높은 수준을 보여 훨씬 더 상세보기에 크게 진행하고있다.
그러나, 광학 현미경의 종래의 방법은 고유의 해상도는 사용하는 여기 광의 파장의 약 절반 인 것을 의미하는 회절 제한적이다. 결과적으로, 심지어 가장 최적 종래 광학 현미경 시스템으로, 가장 외측의 해상도는 약 220-250 나노 미터이고, 축 방향의 해상도는 약 500 ㎚이다 (검토 Schermelleh 외. 2 참조). 특히 박테리아 세포 생물 학자,이 여전히 심각하게이 작은 세포의 공간 조직에 대한 우리의 이해를 제한한다; DIAM 만 ~ 2 μm의 인eter, 길이 1-10 μM. 단백질의 동적 공간 문제가 시험 관내에서 보완 데이터 분석 될 수 생균 수행 가능 높은 해상도의 기술에 대한 필요성이있다.
지난 10 년간 여러 수퍼 – 해상도 형광 이미징 기술이 개발되어왔다. 슈퍼 해상도 현미경은 기존의 광학 현미경으로 얻을 적어도 두 측면 해상도함으로써 회절 장벽을 극복 이미징 기술에 대해 설명합니다. 이러한 기술은 명백 실제 해상도 증가를 만들 발광 조명 및 / 또는 분석을 조작. 초 해상 기술의 세 가지 주요 유형이 현재있다 – 내가) 방출 고갈 현미경 세 (STED)를 자극; 같은 photoactivation 현지화 현미경 4,5 (PALM), 확률 적 광학 재건 현미경과 같은 기술을 포함 ⅱ) 단일 분자 현지화 현미경, <s개별 분자 반환 8 (GDSIM) 최대> 6 (STORM), 직접 STORM 7 (dSTORM), 및 접지 상태 고갈; 및 ⅲ) 구조 조명 현미경 9-12 (SIM). 단일 분자 현지화 기술은 생물학적 시료에서 아래로 10 ~ 40 nm의 사이에, 수평 해상도에서 가장 큰 증가를 제공합니다. 단일 분자 지역화 현미경의 많은 구현에서, 샘플링 깊이가 소멸 파에 한정되고 STED의 초기 구현은 또한 샘플링 깊이가 제한되었다. 축 모두 그러나, 이러한 적응 광학의 사용과 같은 최근의 진보는, 서로 다른 초점 포인트에 점 분포 함수에서의 비 점수차의 착취, 다중 평면 검출 및 발광의 축 방향 위치를 추론하기 위해이 목표를 사용 보았 개선 STED와 단일 분자 현지화 13,14 모두 해상도와 샘플링 깊이. STED에 대한 데이터 수집 속도와 단일 분자 현지화 기술인해 (위치 파악 기술을위한 50,000) 최대 해상도를 취득 할 필요가 화상의 다수 비교적 느리다. 이 느린 데이터 수집은 종종 매우 비싼 사용자 정의 수정없이 라이브 샘플의 이미지에 적합하지 않습니다. 이 두 기술은 최적의 (검토를 위해 2,15 참조) 고정 샘플에 적합하지만, 많은 작업이 제한을 해결하기 위해 수행되고있다.
세 가지 차원 구조 조명 현미경 (3D-SIM)은 약 110 및 280 nm의 각각의 해상도의 결과로 양측과 축 해상도를 향상 넓은 필드 기술이다. 샘플링의 깊이는 전체 세포의 이미징을 허용 coverslip에 30 μm의에 달려있다. 광학 현미경 실험 (OMX) 플랫폼에서 Sedat, Agard 및 Gustaffsson가 개발 한 3D-SIM의 변화는 다른 15로 이동 알려진 그리드 패턴과 샘플을 조명 포함각 Z 평면 9-11에 위치. 관찰 지역 외부 주파수 공간에서 생성 된 결과 모아레 패턴의 무늬가 측정된다. 주파수 공간에서 정보 표시 수퍼 – 해상도 이미지를 생성 할 10,11 계산적으로 재구성된다. 원시 이미지는이 기술을 사용하여 획득 될 수있는 상대 속도는 생균의 촬상을 가능하게한다. 그러나, 초의 시간 규모에서 발생하는 생물학적 과정에 대한 원시 이미지의 수집 속도는 여전히 역동적 인 변화를 포착하기에 너무 속도가 느리다는 점에주의하는 것이 중요하다. 초 캡처 속도와 시간 시리즈의 경우, 충분한 회복 시간없이 반복 인수는 특히 작은 박테리아 세포의 라이브 영상 중, 광독성 및 광표백으로 이어질 수 있습니다.
이러한 문제를 극복하기 위해, 고속 3D-SIM (F3D-SIM)에 대한 최근의 진보가 개발되었다. 여기에서 우리는 내가했다 OMX 블레이즈 (16)로 알려진 하나를 설명이 기술은 이전 시스템에 사용 된 같은 물리적 그리드를 사용하지 않고 패터닝 조명 늦은 2011 년 생성 ntroduced. 광속 및 새로운 셔터 기술을 간섭의 사용은 매우 빠른 방식으로 샘플에 패터닝 된 빛의 생성을 허용한다. 기존 EMCCD 카메라에 비해 화상의 취득 속도는 더욱 특히, 과학 상보성 금속 산화물 반도체 (sCMOS) 카메라의 도입으로 강화되었다. 이러한 변화는 초 (16) 내에서 발생하는 세포 내에서 역동적 인 변화의 모니터링을 허용, 1 μm의 (512 X 512 픽셀, 9 Z-조각)의 샘플링 깊이 초당 프레임의 가능한 이미지 획득 속도되었습니다. 명백한 노출 (여기) 시간의 감소는 장시간 시리즈는 캡처 할 수 있는데,이 법 또는 캡처 속도의 증가를 사용하여 세포를 살고 있습니다.
여기에서 우리는 대해 조사 할 F3D-SIM 현미경의 응용 프로그램을 설명전자 구조 및 두 종의 박테리아 세포에서 cytokinetic Z 링의 동적 운동 : 막대 형상 모델 유기체 고초균과 coccoid 인간 병원체 포도상 구균. FtsZ 박테리아 17,18에서 세포 분열의 중요한 역할을 튜 불린 같은 세포 골격 단백질이다. 이것은 분할 장치 (17, 18)을 형성 적어도 20 다른 분할 단백질 모집 분할 사이트에 편재하고 세포 수축 19-23위한 힘을 제공하는 것으로 여겨진다. 이 방법은 FtsZ가 이질적으로 구슬처럼 배열에서 모두 생물의 Z 링 주위에 분포되어 있음을 알 수; 전자 크라이 단층 촬영 (ECT) (24)에 의해 제안 된 바와 같이 종래의 와이드 필드 형광 현미경, 또는 불연속적인 구조에 의해 시각으로 Z 링, 셀 주변에 연속 균일 벨트인지 오랫동안 유지 문제를 해결. 우리는 3D-SIM의 능력이 훨씬 작은 공간의 검사 (1을 향상시킬 수있는 방법을 보여줍니다μm의 직경) S.처럼 라운드 셀 세 개의 연속 수직 인 평면 (x, y, z)로 분할 구균. 이러한 기술을 이용하여 시간 경과 연구 Z 고리의 구조와 고정 지지체 (24)의 밖으로 이동 더러워 링 내의 조직 변화보다는 FtsZ 분자와 동적 인 것으로 나타났다.
형광 라이브 세포 이미징은 시간이 지남에 따라 세포 내에서 역동적 인 변화의 관찰을 가능하게하는 강력한 도구입니다. 박테리아 세포 생물학의 라이브 영상 때문에 작은 셀 크기의 큰 도전과 여기 광에 반복 노출을 견딜 박테리아 세포의 능력을 감소시켰다. F3D-SIM은 모든 세포 생물학을 심문하는 데 사용할 수있는 도구를 확장했다하지만 제대로 구현하면 유물이 도입 될 수있다주의 깊게이 기술을 수행 할 필요가있다. 이 기술의 성공적인 사용에 대한 중요한 고려 사항들이있다. 그것은 정확한 화상 재구성을 가능하게 피해야한다 발광 굴절률 부정합과 출사 광의 구면 수차의 점 확산 함수의 사용에 의존하여 넓은 필드 형광 촬상 방법이면. 고품질의 0.17 mm 두께의 커버 슬립의 사용으로 인해 커버 유리 두께 변동에 신호 강도의 변동을 피하기 위해입술은 매우 좋습니다. 주의 깊게 모든 실험의 초기 단계 동안 발광의 구면 수차를 평가하고 필요한 침지 오일 굴절률을 조정 중요하다. 이 온도와 샘플의 장착 미디어 / 기판 모두에 의존 이것은 매일마다 다를 수있다. 잘못된 오일의 사용은 이러한 에코 신호 후광과 같은 이미지 아티팩트의 열등한 재구성 될 것이다.
화상 재구성 프로세스의 끝에서, 각각의 위상에 대한 재구성의 품질의 측정치는 조명의 각 단계 / 각도 "코 각도위한 최적"에 의해 얻을 수있다. 이 값은 각각의 각도에 대해 1 이하이면, 재구성의 품질은 아마도 높을 것이다. 이 값이 6 초과 인 경우, 재구성 된 이미지 아티팩트를 포함 할 가능성이 있다는 것이다. 일반 유물 내가보기) 해당 이미지의 줄무늬의 모양을 포함그리드의 각도 중 하나. 이것은 그 그리드 각도에서 낮은 신호로부터 발생할 수 있습니다; ⅱ) 구조의 주위에 haloing. 이 주변 구조에 비해 밝은 구조에서 신호의 매우 고르지 못한 수준으로 인해 발생할 수있는 오일의 굴절률의 불일치 및 샘플이나 이미지가있을 정도로 "구조"를 포함하는 너무 비정질 인하지의 구조에 기인 할 수있다 알고리즘에 의해 인식; 일반적으로 인한 높은 배경 신호, 이미지 신호 대 잡음 비율이 낮은 결과로 III) 'honeycombing'; ⅳ) XY에서 연장 뻗어 아르 구조 / 유가 및 시료의 굴절률이 일치 될 수있다. 이 유물은 경험이 부족한 사용자에 대한 식별하기가 어렵습니다. 그것은이 기술을 사용하기 시작하면 새 사용자가 이미지의 해석과 분석에 대한 조언을 경험 SIM 연구원에 문의하는 것이 좋습니다.
모든 살아있는 세포의 형광 이미징 실험과 마찬가지로 수입은개미 신중 photobleaching에 최소한의 이슈 이미지를 재구성하는 데 필요한 충분한 발광 신호와 셀의 광독성의 정도를 최소화하기 위해 여기 에너지 입력을 균형. 과도한 광표백 (Z 단일 스택 인수에 걸쳐 30 %를 초과)는 재구성 된 이미지의 스트라이프 패턴으로 이어질 것이다. sCMOS 카메라를 이용하여, 초 – 해상도 이미지가 성공적으로 상기 배경 1000 카운트만큼 낮은 발광 신호 원시 이미지로부터 재구성 될 수있다. 이것은 매우 짧은 노출 시간은 이에 광표백을 감소시키고 각각의 프레임에 대한 신속한 포착을 가능하게 허용 할 수있다. 또한, 세포가 여기 에너지의 입력으로부터 회복하기위한 프레임 간의 시간의 양을 증가시킨다. 각각의 개별 프레임에 대한 포착 시간이 매우 짧을 수 또한, 개별 캡처하는 동안 "모션 블러"에 의해 도입 된 아티팩트의 정도는이 방법을 사용하여 감소된다.
이 VARI3D-SIM의 토 오크 박테리아 세포 생물학 의해 실시간 이미징을위한 다른 사용 가능한 슈퍼 고해상도 영상화 기술에 비해 다른 이점들을 제공한다. 3 차원 해상도의 2 배 증가 및 샘플에 30 μm의 이미지에 대한 능력은 실험 기간 동안 전체 세균 (포유 동물) 세포의 이미징을 할 수 있습니다. 일반적으로 사라져가는 파도에 수행하는 등 단일 분자 현지화 같은 기술은 샘플로 침투의 깊이를 달성 할 수 및 전체 세포에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 이 기술에 대한 높은 샘플링 깊이를 허용하는 최근의 발전은 전체 세포의 더 나은 축 해상도가 발생할 수 있습니다. 또한, 또한 공간 해상도로 캡처 할 수 있고, 포착 프레임 율 및 궁극적 달성 공간 해상도 간의 절충해야하는 프레임 레이트에 제한이 획득 될 것의 수천 개의 이미지를 필요로 단일 분자 지역화 기법에 의존 이브의 수정의 된 공간 내에서 기록 국세청. 캡쳐 된 프레임의 수를 줄이면 하부 공간 해상도 초래되지만 관심 생물학적 과정에 필요한 시간 해상도를 달성하기에 충분할 수있다. 프레임 간의 회복 시간은 또한 시계열함으로써 얻을 수있는 재생 시간과 주파수를 제한 생균의 광독성을 최소화하기 위해 증가 될 필요가있다. 이러한 전자 현미경 (EM) 또는 전자 cryotomography (ECT)로서 제공 고해상도 기술은 3D-SIM (그리고 다른 수퍼 – 해상도 광 현미경 기법) 위에 해상도를 증가하지만, 고정 된 샘플들에 대해 수행되어야한다. 고정 처리가 유물을 소개 할 수 있으며 라벨의 부족으로 해석하지 않을 수 있습니다. 라벨없는 ECT 불량 콘트라스트를 가지며 약 500-200 나노 미터 (24)의 샘플의 투과 두께를 달성 할 수 있기 때문에 관심의 단백질이 식별 될 수있는 경우에도, 전체의 박테리아 세포에서의 단백질의 구조는 관찰 할 수 없다.라벨링과 같은 그러한 immunogold EM에 사용될 수있다하더라도, 2 차원 이미징은 수행된다. 3D 얇은 절편 및 섹션의 계산 재건 만 달성 할 수있다. 얇은 절편은 숙련 된 기술자가 필요하지만 문제가 될 및 유물로 이어질 수 있습니다. 라이브 또는 고정 세포로, 3D-SIM은 특정 방식에 포함되는 세포가 빠르게 근처의 기본 상태에서 촬영을 준비 할 수 필요가 없습니다.
이 방법은 형광 현미경에서 최소한의 경험이있는 연구자들에 의해 비교적 쉽게 구현할 수있다. 실험로는, 형광 또는 과도한 배경 신호를 생성하지 않는 건강한 세포의 기능을 지원하는 배지에서 행할 수있다. 박테리아 세포의 경우, 이것은 복잡하고 최소한의 미디어 또는 박테리아 세포 운동성을 제어하는 고체 또는 반고체 매체 사용의 많은 유형의 사용을 허용 할 수있다. 이미 형광 단백질 (FP)를 융합 설계 및 기능을 테스트 한 대부분의 생물 학자이러한 융합은 더 엔지니어링 및 새로운 광활성 FP 융합과 유효성 검사없이 신속하게이 기술을 걸릴 수 있습니다. 우리는 일반적인 관찰로, 발견 S. 구균 B.보다 FP의 융합과 영상 중에 광표백에 더 민감했다 서브 틸리 스. 그리드 패턴은 물리적 격자에 의해 생성 된 오리지널 3D-SIM 방법을 사용하여, 우리는 S.들과 라이브 세포 이미징을 수행 할 수 없습니다 구균 FP 융합. 그러나이 고급 F3D-SIM 방법으로, 우리는 이미지에 이러한 FP 융합 할 수 있었다 이러한 태그 단백질의 역 동성을 포착하는 짧은 시간 시리즈를 수행합니다. 이것은 아마도 촬상에 필요한 세포 복구에 프레임 간의 시간 증가 감소 노출 시간 때문이다.
OMX 블레이즈 3D-SIM은 비교적 용이하게 단일 실험실 또는 코어 촬상 기능에서 구현 될 수있는 상업적으로 이용 가능한 기술이다. 케어 ARTI 않도록 기법을 수행하도록주의해야가난한 샘플 준비 또는 가난한 이미지 캡처로 인해 사실. 기술이 마스터되면 박테리아와 같은 작은 유기체에서의 단백질의 구조 연구 및 역학은 단일 또는 다색 형광 수행 될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank P. Levin, S. Moriya, S. Foster, and M. Pinho for the gift of strains and antibodies. They also thank L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper, and B. Dougherty for expert technical assistance. CBW is supported by an Australian National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (571905). LT was supported by a UTS Chancellors Postdoctoral Fellowship. MPS and ATFL were supported by Australian Postgraduate Awards. This work was supported by an Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) to EJH.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose I (Biotecnology grade) | AMRESCO | 0710-500G | Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media |
N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide (FM 4-64) | Life Technologies | T-13320 | Lipophylic dye used for staining cell membranes. |
1.5 ml microtube, graduated Natural | Scientific specialties Inc. | 1210-00 | Made from Homopolymer polypropylene, Used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization |
Luria broth base, Miller | BD | 241420 | Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2%?? after autoclaving |
BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3 | BD | 210932 | Prepared according to manufacturer's instructions. |
Adhesive frame | Thermo-Fisher Scientific | ABGAB-0577 | Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15x16mm) |
Microscope cover glass | Thermo-Fisher Scientific | 111512-9 | 22×22 No 1 Thickness |
35 mm diameter petri dish with a glass coverslip bottom | World precision instruments | FD35-100 | Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35mm, Glass: Ø 23mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol |
Lincomycin hydrochloride | Sigma | L6004-5MU | Make a 25 mg/ml stock in 50% Ethanol |
Erythromycin | Boehringer Mannheim GmbH | 12390120-14 | Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol |
Combined Orbital/Linear Shaking waterbath | Grant scientific Instruments | OLS-200 | Shaking speed used for cultures: 215 rpm |
UV visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-1601 | 600 nm wavelength was used for measuring Optical density of bacterial cultures |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Pellets of bacterial culture were obtained by spidding down mid exponentially growing cultures at 8000 for 30 seconds |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | 15502-10G | Prepare 1M stock and filter sterilze prior to use |
softWoRx software | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | version 5.0 | |
Imaris data analysis software | Bitplane Scientific Software, Bitplane AG | version 7.0.0 | Matlab XTensions included |
DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module. | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | Blaze module fitted on OMX V3 | |
Upright fluorescence microscope | Zeiss Axioplan 2 |