Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.
Floresan mikroskobu kullanarak biyolojik numunelerin görüntüleme canlı örneklerinin süper çözünürlük sağlayan ışık kırınım çözünürlüğü engeli aşmak için yeni teknolojiler ile büyük ölçüde ilerlemiştir. Uyarılmış emisyon tükenmesi (STED), (örneğin PALM, FIRTINA ve GDSIM gibi teknikler de dahil olmak üzere) tek-molekül yerelleştirme mikroskopi ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) – süper çözünürlük teknikleri üç ana türü vardır. STED'in ve tek-molekül yerelleştirme teknikleri çözünürlükte büyük artışlar gösterirken, onlar görüntü elde artan hızları sunmak için yavaş olmuştur. Üç boyutlu bir SIM (3D-SIM) tek bir molekül lokalizasyonu ve, her iki STED'in üzerinde bir dizi avantaj sunan bir geniş alan floresan mikroskobu tekniğidir. Çözünürlük için izin, lamel tipik yanal ve eksenel 110 çözünürlükte ve 280 nm, sırasıyla ve en fazla 30 mikron örnekleme derinliği ile geliştirildiBütün hücrelerin görüntüleme. Anlamlı fotoğraf-toksisite ve photobleaching düşürürken ham görüntüleri yakalama oranını artırarak teknolojisindeki son gelişmeler (hızlı 3D-SIM), saniyede meydana gelen biyolojik süreçlerin hızlı yakalamak için izin verir. Burada görüntü hücrelerin analiz edilir göstermek için bir floresan etiketli cytokinetic FtsZ protein ve bu teknik sağlayabilir özgü bilgi tipini barındıran bakteri hücreleri böyle bir yöntemin kullanılmasını tarif eder.
Farklı görüntüleme teknolojilerinin çok sayıda çeşitli elektron ve optik mikroskopi teknikleri dahil bakterileri incelemek için yılda kullanılmıştır. Elektron mikroskobu derece yüksek çözünürlüğü sunarken, nanometre aşağı, bir vakum ve kontrast maddelerin kullanımı için ihtiyaç sabit ve gömülü dokulardan için bu tekniği sınırlıdır. Eserler de nedeniyle uzun numune hazırlama ve yetenekli bir uygulayıcı örnekleri hazırlamak, ve elde edilen görüntüleri analiz etme ve yorumlama için gerekli sokulabilir. Optik mikroskopi basit örnek hazırlama ve elektron mikroskopi ile karşılaştırıldığında nispeten kolay bir şekilde birden fazla etiket uygulama avantajları sunar. Floresan proteinler ve boya karışımları, floresan mikroskobu ile canlı hücreleri üstünde çalışılmasını sağlar kullanılması da mümkündür. Kamera algılama Techn hücre toksisitesi, hem de gelişmeler azalmasına yol açan florofor kararlılık ve floresan protein boyut / yapısında iyileştirmelerleology, geniş alan ve konfokal görüntüleme sistemleri kullanılarak floresan mikroskopi anlamlı hücrelerin mekansal dinamiklerini anlamamızı sağlamıştır. Bu teknikler kullanılarak, son 20 yılda bakteri hücresi bilgimizi bakteri hücresi 1 içinde yapısal ve protein örgütün üst seviyede ortaya çok daha detaylı bir görünümüne büyük ölçüde ilerlemiştir.
Bununla birlikte, optik mikroskopi için geleneksel yöntemler doğal çözünürlüğü, kullanılan uyarım ışığının dalga boyu yaklaşık yarısı olan, yani kırılma sınırlıdır. Sonuç olarak, hatta en uygun geleneksel optik mikroskop sistemi ile, en iyi yanal çözünürlük yaklaşık 220-250 nm ve eksenel çözünürlük yaklaşık 500 nm (inceleme için Schermelleh vd. 2 bakınız). Özellikle bakteriyel hücre biyologlar için bu hala ciddi bu küçük hücrelerin mekansal organizasyon anlayışımızı sınırlar; çapı yalnızca 1-2 mikron olmaketresi ve uzunluğu 1-10 mikron. Bir proteinin, dinamik uzaysal davranışı in vitro verileri tamamlamak için analiz edilebilir canlı hücreler üzerinde gerçekleştirilebilir yüksek çözünürlük teknikleri için bir ihtiyaç söz konusudur.
Geçtiğimiz on yıl içinde, birkaç süper-çözünürlüklü floresan görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir. Süper çözünürlük mikroskopi geleneksel ışık mikroskopisi ile elde edilebilen en az iki yanal çözünürlüğü, böylece kırılma bariyer üstesinden görüntüleme teknikleri tarif etmektedir. Bu teknikler belirgin çözünürlükte gerçek artış oluşturmak için yayılan ışığın ışık ve / veya analiz işlemek. Süper çözünürlük teknikleri üç ana türü vardır – i) emisyon tükenmesi mikroskobu 3 (STED) uyarılmış; Böyle fotoaktivasyon yerelleştirme mikroskobu 4,5 (PALM), Stokastik optik yeniden mikroskop gibi teknikleri de dahil olmak ii) tek-molekül yerelleştirme mikroskopi, <sbireysel molekül karşılığında 8 (GDSIM) ile> 6 (STORM), direkt STORM 7 (dSTORM), ve temel hal incelmesi; iii) yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu 9-12 (SIM). Tek molekül lokalizasyon teknikleri, biyolojik numunelerde aşağı nm 10-40 arasında, lateral çözünürlükte büyük artışlar sunuyoruz. Tek molekül yerelleştirme mikroskobu birçok uygulamasında, örnekleme derinliği kaybolan dalga sınırlıdır ve STED'in ilk uygulamaları da örnekleme derinliği sınırlı kalmıştır. Eksenel hem Ancak, bu tür adaptif optik kullanımı gibi son gelişmeler, farklı odak noktalarında nokta dağılım fonksiyonu astigmatizma sömürülmesi, çok düzlemli algılama ve yayılan ışığın eksenel konumunu anlaması için iki hedefleri kullanarak gördük gelişmeler STED'in ve tek molekül lokalizasyon 13,14 hem de çözünürlük ve örnekleme derinlikleri. STED'in için Veri toplama oranları ve tek-molekül lokalizasyon tekniklerinedeniyle (yerelleştirme tekniklerine kadar 50,000) maksimum çözünürlük için edinmesi gereken görüntülerin çok sayıda da nispeten yavaştır. Bu yavaş veri toplama genellikle oldukça pahalı olan özel bir değişiklik yapmadan canlı örneklerinin görüntüleme kendisini ödünç değil. Bu iki teknikleri halen optimal (inceleme için 2,15 bakınız) sabit örnekleri için uygundur, ancak, çok iş bu sınırlama çözmek için yapılıyor.
Üç boyutlu yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) yaklaşık 110 ve 280 nm, sırasıyla çözünürlüklerde sonuçlanan hem yanal ve eksenel çözünürlüğünü arttıran geniş alan tekniktir. Örnekleme derinliği Bütün hücrelerin görüntüleme için izin lamel 30 um kadardır. Optik mikroskop kullanılarak, deneysel (OMX) platformunda Sedat, Agard ve Gustaffsson tarafından geliştirilen 3D-SIM'in birbirlerinden farklı, 15 hareket eden bir bilinen bir ızgara deseni ile Numuneyi aydınlatan içerirHer bir Z düzlemi 9-11 konumları arasında olabilir. Gözlemlenebilir bölgenin dışında frekans alanı oluşturulur edilen Moire desen saçaklar ölçülür. Frekans uzaydan bilgiler görünür süper-çözünürlüklü görüntü 10,11 oluşturmak için hesaplama yeniden olduğunu. Ham görüntüler bu tekniği kullanarak elde edilebilir hangi göreli hız canlı hücre görüntüleme sağlar. Bununla birlikte, saniyelik bir zaman ölçeği üzerinde meydana gelen biyolojik süreçler için, ham görüntülerin elde oranı hala dinamik değişiklikleri yakalamak için çok yavaş olduğuna dikkat etmek önemlidir. Saniyelik bir yakalama oranıyla zaman serisi için, yeterli toparlanma süresi olmadan tekrarlanan toplama özellikle küçük bakteri hücreleri canlı görüntüleme sırasında, fototoksisite ve photobleaching yol açabilir.
Bu sorunların üstesinden gelmek için, hızlı 3D-SIM (F3D-SIM) için son gelişmeler geliştirilmiştir. Burada ben oldu OMX Blaze 16 olarak bilinen birini betimlemekBu teknoloji, önceki sistemlerinde kullanılan gibi fiziksel bir ızgara kullanılmadan desenli aydınlatma 2011 sonlarında oluşturur ntroduced. Işık ışınlarını ve yeni teknoloji çekim müdahale kullanılması çok hızlı bir şekilde, numune üzerinde desenli ışığın oluşturulmasını sağlar. Mevcut EMCCD kameralara kıyasla görüntü elde hızı daha da özellikle, bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) kameraların tanıtımı ile geliştirilmiştir. Bu değişiklikler saniye 16 içinde meydana hücrelerin içindeki dinamik değişikliklerin izlenmesini sağlayan, 1 mikron (512 x 512 piksel, 9 z-dilim) bir örnekleme derinliği saniyede bir çerçeve olası bir görüntü elde etme oranı sonuçlandı. Belirgin maruz kalma (uyarma) zamanlarında düşüş uzun zaman serisi çekilecek verir ya bu yöntemi veya yakalama oranında bir artış kullanarak hücreleri yaşamak için.
Burada Examin için F3D-SIM mikroskopi uygulamasını tarifE yapı ve iki bakteriyel tür hücrelerde cytokinetic Z halka dinamik hareketi: çubuk-şekilli bir model organizma, Bacillus subtilis ve kokoid insan patojeni Staphylococcus aureus. 17,18 FtsZ bakteri hücre bölünmesi önemli bir rol oynayan bir tübülin-benzeri hücre iskeleti proteindir. Bu, bölme düzeneği 17,18 oluşturan polimer, en az 20 farklı bölümü proteinler işe bölme sitesine lokalize ve hücre için 19-23 daralma kuvveti sağlamak olduğuna inanılmaktadır. Bu yöntem FtsZ heterojen bir boncuk gibi düzenleme hem organizmalarda Z halka etrafında dağıtılır olduğunu ortaya koymaktadır; Elektron cryo tomografi (ECT) 24 tarafından önerildiği gibi, geleneksel geniş alan floresan mikroskobu ya da sürekli olmayan bir yapı ile gösterildiği gibi Z halka, hücre etrafında sürekli ve tek biçimli kayış olup uzun tutulan sorunu çözer. Biz 3D-SIM yeteneği büyük ölçüde küçük mekansal muayene (1 nasıl geliştirebileceğimizi gösteriyormikron çapında) S. gibi yuvarlak hücreler arka arkaya üç dikey düzlemde (x, y, z) bölmek aureus'dur. Bu teknikler kullanılarak zaman atlamalı çalışmalar Z halkasının yapısı ve sabit bir iskele 24 üzerinden hareket eden bütün halka içinde kurum değişikliklerin yerine FtsZ molekülleri ile, dinamik olduğunu göstermektedir.
Floresan canlı hücre görüntüleme zamanla hücre içindeki dinamik değişiklikleri gözlem sağlayan güçlü bir araçtır. Bakteriyel hücre biyolojisi imaj için küçük hücre boyutuna sahip olan ve zor uyarım ışığına sürekli temas dayanma bakteriyel hücrelerin yeteneği azaltmıştır. F3D-SIM tüm hücre biyolojisi sorgulamak için kullanılabilir araçları genişletti ama kötü uygulandığı takdirde eserler sokulabilir gibi dikkatle bu tekniği gerçekleştirmek için gereklidir. Bu tekniğin başarılı kullanımı açısından önemli hususlar vardır. Bu doğru bir resim rekonstrüksiyonu için kaçınılmalıdır yayılan ışık, kırılma endeksi uyumsuzluğu ve yayılan ışığın küresel sapma noktası dağılım fonksiyonu kullanımına dayanan bir geniş alan flüoresan görüntüleme yöntemidir. Yüksek kalitede, 0.17 mm kalınlığında lamelleri kullanılması nedeniyle kapakların cam kalınlığı değişkenlik sinyal yoğunluğu değişimini önlemekdudak tavsiye edilir. Dikkatle tüm deneylerin ilk aşamalarında yayılan ışığın küresel sapmayı değerlendirmek ve gerektiğinde daldırma yağ kırılma indeksi ayarlamak için kritik önem taşımaktadır. Bu örneğin sıcaklık ve montaj ortamı / alt-tabaka hem de hassas olması nedeniyle bu gün için gün arasında değişebilir. Yanlış yağ kullanımı, haleler ve eko sinyalleri gibi eserler ile görüntülerin alt yeniden neden olacaktır.
Görüntü Yeniden yapılanma işleminin sonunda, her bir aşama için yeniden kalitesi ölçüsüdür aydınlatma her aşaması / açısı için "k O açısı için en uygun" elde edilebilir. Bu değer, her bir açı için 1 altındaysa, o zaman yeniden kalitesi büyük olasılıkla yüksek olacaktır. Bu değer 6 üzerinde ise, bu yeniden oluşturulmuş görüntü dıştan müdahale ürünleri içerecektir daha muhtemeldir. Ortak eserler i) karşılık görüntüde çizgili görünüm sayılabilirIzgaranın açıları birine. Bu, ızgara açıdan düşük sinyal kaynaklanabilir; ii) yapıların etrafında haloing. Bu, çevredeki yapılara kıyasla parlak yapılardan sinyalin çok dengesiz seviyelerinden neden olabilir, petrol kırılma indeksi, bir uyumsuzluk ve numune veya görüntü olması için yeterli "yapısı" içeren çok amorf olmak ve değil yapılara bağlı olabilir algoritması tarafından tanınan; Genellikle, yüksek bir zemin sinyali için, görüntü gürültü oranı düşük bir sinyal sonucu iii) 'bal peteği'; iv) xy uzatılmış gergin yapıları / nedeniyle yağ ve örnek kırılma indeksi uyumsuzluğuna bağlı olabilmektedir. Bu yapıyı deneyimsiz kullanıcı için ayırt etmek zordur. Bu tekniği kullanmak başlarken yeni kullanıcılar görüntü yorumlama ve analiz tavsiye için deneyimli bir SİM araştırmacı danışmanız tavsiye edilir.
Tüm floresan canlı hücre görüntüleme deneyleri ile olduğu gibi, ithalatkarınca dikkatli bir şekilde ve en az Photobleaching artefakt görüntüler tekrar oluşturulması için gerekli yeterli bir emisyon sinyali ile hücrelerin fototoksisite derecesini en aza indirmek için uyarım enerji girişi dengelemek için. Aşırı ışıkla ağartma (tek bir z-yığın devir arasında% 30'dan daha fazla) yeniden kurulmuş görüntü içindeki çizgi desen yol açacaktır. SCMOS kameraların kullanımı ile, süper çözünürlüklü görüntüler başarıyla arka plan üzerinde 1.000 sayıları gibi düşük emisyon sinyali ile ham görüntüleri yeniden inşa edilebilir. Bu çok kısa pozlama süreleri böylece photobleaching azaltmak ve her kare için hızlı yakalama etkinleştirmek için izin verebilirsiniz. Aynı zamanda hücreler, uyarım enerji girişi kurtarmak için çerçeveler arasındaki süreyi arttırır. Her bir çerçeve için yakalama süresi çok kısa olabilir, İlave olarak, tek bir çekim sırasında 'hareket bulanıklığı yayınladıkları artefaktının derecesi bu yöntemin kullanılması ile indirgenir.
Bu vari3D-SIM tirme bakteriyel hücre biyologlar tarafından canlı görüntüleme için kullanılabilir diğer süper ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknolojileri üzerinden diğer bir takım avantajlar sunuyor. 3-boyutlu çözünürlükte 2 kat artış ve bir numune içine 30 mikron kadar görüntü yeteneği bir deney sırasında tüm bakteri (ve memeli) hücre görüntüleme sağlar. Genel olarak çabuk kaybolan dalgalı gerçekleştirilir bu tip bir tekli-molekül lokalizasyonu gibi teknikler, bir numune içine nüfuz derinliği elde edemez ve bütün hücrelerin hakkında bilgi sağlamaz. Bu teknik için yüksek örnekleme derinlikleri izin son gelişmeler, tam hücrelerde daha iyi çözünürlük eksenel neden olabilir. Ayrıca, aynı zamanda mekansal çözünürlüğü olarak, yakalanabilir ve yakalama kare hızı ve nihai elde uzamsal çözünürlük arasındaki uzlaşma isteyebilir kare hızı sınırlıdır elde edilecek ham görüntüleri binlerce gerektiren tek-molekül lokalizasyon teknikleri bağlıdır eve sayısıTanımlanmış bir alan içinde kaydedilen NTS. Yakalanan kare sayısını azaltılması daha düşük bir uzamsal çözünürlük ile sonuçlanır, fakat söz konusu biyolojik işlemi için gerekli olan zamansal çözünürlüğü elde etmek için yeterli olabilmektedir. Çerçeveler arasında iyileşme süresi miktarı da bu şekilde zaman serisi elde edilebildiği de süresini ve sıklığını sınırlayıcı Canlı hücrelerdeki fototoksisite en aza indirmek için artırılması gerekebilir. Elektron mikroskobu (EM) veya elektron cryotomography (EKT) teklif olarak Yüksek çözünürlüklü teknikler 3D-SIM (ve diğer süper-çözünürlüklü optik mikroskopi teknikleri) üzerinde çözünürlüğü arttı ancak sabit numuneler üzerinde yapılmalıdır. Sabitleme ve işleme eserleri tanıtmak olabilir ve etiketleme eksikliği yorumlanması zor hale getirebilir. Etiket içermeyen ECT kötü kontrast ve yaklaşık 500-200 nm 24 numunesi, penetrasyon derinliklerinde elde edilebilir, yani, ilgi konusu proteinin tespit edilebilir olsa bile, bütün bir bakteri hücresinde proteininin yapısı izlenememektedir.Etiketleme gibi immünolojik gibi EM, kullanılabilir bile, 2D sadece görüntüleme gerçekleştirilir. 3D ince ince kesilir ve bölümlerin hesaplama rekonstrüksiyonu ile yalnızca ulaşılabilir. Ince kesit deneyimli bir teknisyen gerektirir ama sorunlu ve artefakt yol açabilir. Canlı hücreler ya da sabit olan, 3D-SIM özel bir şekilde gömülü olması için ve hücrelerin hızlı bir şekilde yakın bir yerli durumda görüntüleme için hazırlanabilir gerek yoktur.
Bu yöntem floresan mikroskopi minimal deneyime sahip araştırmacılar tarafından uygulanması nispeten kolaydır. Deneyler sürece floresan arka plan sinyal ya da aşırı üretmez sağlıklı hücre işlevini destekleyen ortam içinde yapılabilir. Bakteriyel hücreler için, bu karmaşık ve en az bir ortam veya bakteriyel hücre motilitesini kontrol etmek için katı ya da yan-katı ortam kullanımından birçok türde kullanılmasına olanak sağlamaktadır. Zaten floresan proteininin (FP) füzyonlan mühendislik ve işlevselliğini test ettik Birçok biyologBu füzyon fazla mühendislik ve yeni fotoaktıfleştırılebılır FP füzyonlarında doğrulama olmadan hızla bu teknolojiyi kadar sürebilir. Biz, genel bir gözlem olarak, bulduğu S. aureus B'den daha FP füzyonlarında görüntüleme sırasında photobleaching daha duyarlı oldu subtilis. Izgara desen fiziksel bir ızgara tarafından oluşturulan orijinal 3D-SIM yöntemler kullanarak, biz S. bir dizi ile canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek için koyamadık aureus, FP füzyonlar. Ancak, bu gelişmiş F3D-SIM yöntemi ile, biz görüntüye bu FP füzyonlarını başardık ve bu etiketli proteinlerin dinamiklerini yakalamak için kısa bir süre dizi gerçekleştirmek. Bu en büyük ihtimalle görüntüleme için gerekli ve hücre iyileşme için çerçeveler arasındaki zaman artan maruz kalma oranını kere kaynaklanmaktadır.
OMX yangını 3D-SİM nispeten kolay bir şekilde, tek bir laboratuar ya da bir çekirdek görüntüleme birimi uygulanabilir bir ticari olarak temin edilebilir bir teknolojidir. Bakım arti önlemek için tekniğin seçilmesi alınmalıdırkötü örnek hazırlama veya kötü görüntü yakalama nedeniyle gerçekler. Teknik hakim sonra, bakteriler gibi küçük organizmaların protein yapı çalışmaları ve dinamikleri, tek veya çok renkli floresan gerçekleştirilebilir.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank P. Levin, S. Moriya, S. Foster, and M. Pinho for the gift of strains and antibodies. They also thank L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper, and B. Dougherty for expert technical assistance. CBW is supported by an Australian National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (571905). LT was supported by a UTS Chancellors Postdoctoral Fellowship. MPS and ATFL were supported by Australian Postgraduate Awards. This work was supported by an Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) to EJH.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose I (Biotecnology grade) | AMRESCO | 0710-500G | Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media |
N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide (FM 4-64) | Life Technologies | T-13320 | Lipophylic dye used for staining cell membranes. |
1.5 ml microtube, graduated Natural | Scientific specialties Inc. | 1210-00 | Made from Homopolymer polypropylene, Used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization |
Luria broth base, Miller | BD | 241420 | Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2%?? after autoclaving |
BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3 | BD | 210932 | Prepared according to manufacturer's instructions. |
Adhesive frame | Thermo-Fisher Scientific | ABGAB-0577 | Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15x16mm) |
Microscope cover glass | Thermo-Fisher Scientific | 111512-9 | 22×22 No 1 Thickness |
35 mm diameter petri dish with a glass coverslip bottom | World precision instruments | FD35-100 | Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35mm, Glass: Ø 23mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol |
Lincomycin hydrochloride | Sigma | L6004-5MU | Make a 25 mg/ml stock in 50% Ethanol |
Erythromycin | Boehringer Mannheim GmbH | 12390120-14 | Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol |
Combined Orbital/Linear Shaking waterbath | Grant scientific Instruments | OLS-200 | Shaking speed used for cultures: 215 rpm |
UV visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-1601 | 600 nm wavelength was used for measuring Optical density of bacterial cultures |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Pellets of bacterial culture were obtained by spidding down mid exponentially growing cultures at 8000 for 30 seconds |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | 15502-10G | Prepare 1M stock and filter sterilze prior to use |
softWoRx software | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | version 5.0 | |
Imaris data analysis software | Bitplane Scientific Software, Bitplane AG | version 7.0.0 | Matlab XTensions included |
DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module. | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | Blaze module fitted on OMX V3 | |
Upright fluorescence microscope | Zeiss Axioplan 2 |