Полное Травма спинного мозга и мозга Вскрытие протокол для последующего Wholemount<em> На месте</em> Гибридизация в личинок морская минога
Summary
Миноги восстановить двигательную после полной травмы спинного мозга. Тем не менее, некоторые спинальные-проектирование нейроны являются хорошими регенераторов, а другие нет. Эта статья иллюстрирует методы для жилья морская минога личинок (и недавно преобразованных взрослых), производить полные transections спинного мозга и подготовке Wholemount мозги и спинного мозга для гибридизация.
Abstract
После полного повреждения спинного мозга, морские миноги сначала парализованы ниже уровня перерезки. Тем не менее, они выздоравливают передвижение через несколько недель, и это сопровождается короткие расстояния регенерации (несколько мм) проприоцептивных аксонов и спинного-проектирование аксонов от мозга. Среди 36 крупных идентифицируемых спинного-проектирование нейронов, некоторые из них хорошие регенераторов и другие плохие регенераторов. Эти нейроны могут быть наиболее легко идентифицировать в Wholemount препаратов ЦНС. Для того, чтобы понять нейронные-внутренняя механизмы, способствующие или ингибировать регенерацию аксонов после травмы у позвоночных ЦНС, мы определить различия в экспрессии генов между хорошими и плохими регенераторов, и как выражение под влиянием перерезки спинного мозга. Эта статья иллюстрирует методы для жилищного личинок и недавно преобразованные взрослых на море миноги в резервуарах пресной воды, производя полную позвоночника transections кабель под микроскопического зрения, и подготовка брайн и спинного wholemounts шнур для гибридизация. Вкратце, животных содержат в 16 ° C и под наркозом в 1% Benzocaine в миноги Ringer. Спинной мозг пересекается с иридэктомия ножницами через спинной подхода и животное разрешено восстановить в цистернах пресной воды при 23 ° С. Для гибридизация, животные reanesthetized и мозг и шнур удаляют через спинной подхода.
Introduction
У млекопитающих повреждение спинного мозга (SCI) является разрушительным условии, что приводит к постоянной потере функции ниже места повреждения, потому что поврежденные аксоны не восстанавливаются через зону травмы и снова в соответствующие целям. В отличие от млекопитающих, миноги восстановить двигательную после полного повреждения спинного мозга. 1 Интересно, миноги есть набор 36 спинного мозга проектирование нейроны, которые по отдельности идентифицировать в целом монтажа препараты мозга за их большой размер 2,3 (рис 1) . Все эти спинного-проектирование нейронов аксотомизированных путем полного рассечения спинного мозга на высоком уровне. Предыдущие исследования нашей группы и других показали, что даже в присутствии функционального восстановления после ТСМ некоторые из этих нейронов показать очень низкую способность к регенерации (они считаются "плохими регенераторов"), в то время как другие, как правило, восстановить их аксоны через сайт травмы (они считаются "гOOD регенераторов "). 2,3 Эта характеристика делает миног интересную модель позвоночных изучить различия в экспрессии генов между хорошим и плохим регенератора спинного-проектирование нейронов, что, в свою очередь приведет к различиям в собственной регенеративной способности нейронов, которые пытаются регенерировать свои аксоны в той же внешней среды. 1
Используя эту модель мы уже показали, что спинного проектирование нейроны с низкой регенеративной способности шоу выражения аксональных рецепторов молекул руководство как UNC5 4,5 и neogenin, 6, которые опосредуют тормозящее действие Netrin и агр соответственно. Кроме того, с помощью этого метода наша группа также показано, что только хорошие регенераторы показывают восстановление экспрессии нейрофиламентов после травмы и в процессе регенерации. Недавно Буш и Morgan 7 показали иммунофлуоресценцией что плохие регенераторов показать повыред выражение синуклеина после травмы, которая была связана авторами с тем, что "плохо" регенератора спинного выступающие нейроны медленно умирать после полной рассечение спинного мозга 5,7,8. Так, минога модель полной травмы спинного мозга возник как очень полезную модель, чтобы понять, что делает спинного мозга проектирование нейрон "плохо регенератор" после аксотомии.
Для проведения наших исследований мы выполняем полный спинной протокол хирургии шнур рассечение и рассечение задней мозговой в нужных точках времени после травмы для выполнения Wholemount в гибридизация. В данной методической статье мы представляем подробный протокол для надлежащего исполнения полного повреждения спинного мозга хирургии в личиночной миног, последующее техническое обслуживание животных и окончательный рассечение мозга и подготовка мозга для Wholemount в гибридизация. Подробный протокол до реrform на Wholemount в гибридизация в мозге личинок миноги уже сообщалось ранее. 9 Кроме того, этот протокол для травмы спинного и головного мозга вскрытия может быть также использован для затем обработать мозги для иммуногистохимии или других гистологических методов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем подробный протокол для выполнения полного перерезки спинного мозга и заднюю рассечение мозга в личиночной морских миног. Эта процедура позволяет анализировать различия в экспрессии генов между идентифицировать спинного мозга, выступающих нейронов после травм?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Antón Barreiro-Iglesias was supported by the Fundación Barrié (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
Referências
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
- Davis, G. R., McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
- Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
- Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
- Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
- Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
- Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
- Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
- Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults. Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).
- Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin. Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).
- Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys. Neurociência. 90, 957-965 (1999).
