Komplette Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protokoll für spätere Wholemount<em> In-situ</em> Hybridisierung in Larven Seeneunauge
Summary
Neunaugen erholen Fortbewegung nach einer kompletten Rückenmarksverletzungen. Jedoch einige Rücken ragenden Neuronen sind gut Regeneratoren sind und andere nicht. Dieses Papier zeigt die Techniken für den Wohnungsbau Meerneunauge Larven (und vor kurzem umgewandelt Erwachsene), Herstellung vollständiger Rückenmarksquerschnitten erhalten und Vorbereitung wholemount Gehirn und Rückenmark für die in situ-Hybridisierung.
Abstract
Nach einer kompletten Rückenmarksverletzungen, werden Meerneunaugen auf den ersten unter dem Niveau der Durchtrennung gelähmt. Bewegungs jedoch erholen sie nach mehreren Wochen, und dies wird durch kurzes Stück Regeneration (einige mm) von propriospinale Axonen und Rücken ragenden Axone aus dem Hirnstamm begleitet. Unter den 36 großen erkennbaren Rücken ragenden Neuronen, sind einige gute Regeneratoren und andere sind schlecht Regeneratoren. Diese Neuronen können am einfachsten in wholemount CNS Vorbereitungen identifiziert werden. Um die Neuron-intrinsische Mechanismen, begünstigen oder hemmen verstehen Axon Regeneration nach Verletzung im ZNS der Wirbeltiere, bestimmen wir Unterschiede in der Genexpression zwischen den guten und schlechten Regeneratoren und wie Expression durch Rückenmarksdurchtrennung beeinflusst. Dieses Papier zeigt die Techniken für die Larvengehäuse und vor kurzem umgewandelt Erwachsenen Seeneunaugen in Frischwassertanks, produziert komplette Rückenmarksquerschnitten erhalten unter mikroskopischer Sicht, und die Vorbereitung brAin und Rückenmark wholemounts für in situ-Hybridisierung. Kurz gesagt, werden die Tiere bei 16 gehalten ° C und in 1% Benzocain in Neunauge Ringer betäubt. Das Rückenmark ist mit Iridektomie Schere über einen dorsalen Zugang durchtrennt und das Tier darf in Frischwassertanks bei 23 ° C erholen. Für in-situ-Hybridisierung werden die Tiere reanästhesiert und die Gehirn und Rückenmark über einen dorsalen Zugang entfernt.
Introduction
Bei Säugetieren Rückenmarksverletzungen (SCI) ist eine verheerende Erkrankung, die zu dauerhaften Verlust der Funktion unterhalb der Verletzungsstelle führt, weil verletzt Axone nicht durch das Trauma Zone zu regenerieren und wieder in die entsprechenden Ziele. Im Gegensatz zu Säugetieren, Neunaugen erholen Fortbewegung nach einer kompletten Rückenmarksverletzungen. 1 Interessanterweise Neunaugen haben einen Satz von 36 Rückenmark hervorstehenden Neuronen, die in individuell identifizierbar sind ganze Gehirn-Mount-Präparate wegen ihrer großen Größe 2,3 (Abbildung 1) . Alle diese Rücken ragenden Neuronen werden von einer hochrangigen komplette Durchtrennung des Rückenmarks axotomisierten. Frühere Studien unserer Gruppe und andere haben gezeigt, dass auch in der Gegenwart die funktionelle Erholung nach einer Rückenmarks einige dieser Neuronen zeigen eine sehr geringe Regenerationsfähigkeit (sie werden als "schlecht Regeneratoren"), während andere in der Regel regenerieren ihre Axon durch den Ort der Verletzung (sie werden als "gOOD Regeneratoren "). 2,3 Diese Eigenschaft macht Neunaugen eine interessante Wirbeltiermodell, um die Unterschiede in der Genexpression zwischen guten und schlechten Regenerator Rücken ragenden Neuronen, die wiederum auf die Unterschiede in der intrinsischen Regenerationsfähigkeit von Neuronen, die versuchen Leitstudie regenerieren ihre Axone in der gleichen äußeren Umgebung. 1
Mit diesem Modell haben wir bereits gezeigt, dass Rücken ragenden Neuronen mit niedrigen Regenerationsfähigkeit zeigen Ausdruck der axonalen Führung Molekül Rezeptoren wie UNC5 4,5 und Neogenin, 6, die die hemmende Wirkung von Netrin und RGM bzw. zu vermitteln. Darüber hinaus kann durch diese Methode unserer Gruppe hat auch gezeigt, dass nur die guten Regeneratoren zeigen eine Erholung der Ausdruck von Neurofilamenten nach der Verletzung und während des Regenerationsprozesses. Kürzlich, Busch und Morgan 7 wurden durch Immunfluoreszenz gezeigt, dass die schlechten Regeneratoren zeigen eine zunehed Expression Synuclein nach der Verletzung, die von den Autoren der Tatsache, dass die "schlechte Regenerator" spinal ragenden Neuronen langsam nach einer vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks 5,7,8 sterben bezogen wurde. So hat sich die Neunaugen Modell eines kompletten Rückenmarksverletzung als ein sehr nützliches Modell zu verstehen, was eine Rückenmark hervorstehenden Neuron eine "schlechte Regenerator" nach Axotomie entstanden.
Unseren Untersuchungen führen wir führen eine komplette Durchtrennung des Rückenmarks-Chirurgie-Protokoll und eine hintere Gehirn Dissektion bei den gewünschten Zeitpunkten nach der Verletzung von wholemount in-situ-Hybridisierung durchzuführen. In der vorliegenden methodischen Artikel stellen wir ein ausführliches Protokoll für die ordnungsgemäße Durchführung eines kompletten Rückenmarksverletzungen Chirurgie in Larvenneunaugen, die anschließende Pflege der Tiere und die letzte Gehirn Präparation und Vorbereitung des Gehirns für eine wholemount in-situ-Hybridisierung. Ein detailliertes Protokoll perform die Wholemount in situ-Hybridisierung im Gehirn von Larven Neunaugen wurde bereits berichtet. 9 Darüber hinaus kann dieses Protokoll für die Verletzung des Rückenmarks und des Gehirns Präparation auch verwendet werden, um dann verarbeitet das Gehirn für die Immunhistochemie oder anderen histologischen Methoden werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier präsentieren wir Ihnen ein ausführliches Protokoll, um eine komplette Durchtrennung des Rückenmarks und hinteren Hirn Dissektion in Larvenmeerneunaugen durchzuführen. Dieses Verfahren ermöglicht die Analyse Unterschiede in der Genexpression zwischen den identifizierbaren Rückenmark vorst Neuronen nach einer Rückenmarksverletzung durch eine ganze Montage Gehirn in situ Hybridisierung. Der kritische Schritt in dem Verfahren ist die korrekte Ausführung einer vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks, die d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Antón Barreiro-Iglesias was supported by the Fundación Barrié (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
Referências
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