Komplett ryggmargsskade og Brain Dissection Protokoll for Følgende Wholemount<em> In Situ</em> Hybridisering i Larve Sea Lamprey

Summary

Lampreys gjenopprette bevegelse etter en komplett ryggmargsskade. Men noen spinal-projisere nevroner er gode regenerators og andre ikke. Denne artikkelen illustrerer teknikker for boliger havet lamprett larver (og nylig forvandlet voksne), som produserer komplette ryggmargs transections og forbereder wholemount hjerne og ryggmargen for in situ hybridisering.

Abstract

Etter en komplett ryggmargsskade, er havet lampreys på første lammet under nivået for tran. Men gjenopprette de locomotion etter flere uker, og dette er ledsaget av kort avstand regenerering (noen mm) av propriospinal axoner og spinal-projisere axoner fra hjernestammen. Blant de 36 store identifiserbare spinal-projisere nevroner, noen er gode regenerators og andre er dårlige regenerators. Disse nevronene lettest kan identifiseres i wholemount CNS forberedelser. For å forstå nervecellen-iboende mekanismer som favoriserer eller hemme axon regenerering etter skade i virveldyr CNS, avgjør vi forskjeller i genuttrykk mellom de gode og dårlige regenerators, og hvordan uttrykket påvirkes av ryggmargen tran. Denne artikkelen illustrerer teknikker for boliger larve og voksen nylig forvandlet sjøen lampreys i ferskvannstanker, som produserer komplette ryggmargs transections henhold mikroskopisk syn, og forbereder brain og ryggmargs wholemounts for in situ hybridisering. Kort, blir dyrene holdt ved 16   ° C og bedøvet i 1% Benzokain i niøye Ringer. Ryggmargen er transektert med iridectomy saks via en rygg tilnærming og dyret er lov til å komme i ferskvannstanker ved 23 ° C. For in situ hybridisering, blir dyrene reanesthetized og hjernen og ledningen fjernes via en dorsal tilnærming.

Introduction

Hos pattedyr ryggmargsskade (SCI) er en ødeleggende tilstand som fører til permanent tap av funksjon under skadestedet fordi skadde axoner ikke regenerere gjennom traumer sonen og koble til sine respektive mål. I motsetning til pattedyr, lampreys gjenopprette bevegelse etter en fullstendig ryggmargsskade. ^Ett Interessant lampreys har et sett av 36 ryggmargen som rager nevroner som er enkeltvis identifiserbare i hel-montere hjerne preparater på grunn av deres store størrelse ^2,3 (figur 1) . Alle disse spinal-neuroner blir utragende axotomized ved et høyt nivå komplett ryggmargstranseksjon. Tidligere studier av vår gruppe, og andre har vist at selv i nærvær av funksjonell restitusjon etter SCI noen av disse neuroner viser en svært lav evne til reproduksjon (de anses som "dårlig regeneratorer"), mens andre vanligvis regenerere deres axon gjennom skadestedet (de regnes som "good regenerators "). ^2,3 Denne egenskapen gjør lampreys en interessant virveldyr modell for å studere forskjeller i genuttrykk mellom gode og dårlige regenerator spinal-projisere nevroner som i sin tur vil føre til forskjeller i den iboende regenererende evne nevroner som forsøker å regenerering av aksoner i den samme ytre miljø. ^ett

Ved hjelp av denne modellen vi har tidligere vist at spinal-projisere nevroner med lav regenerativ evne vis uttrykk for aksonale veiledning molekyl reseptorer som UNC5 ^4,5 og neogenin, ⁶ som medierer den hemmende virkningen av netrin og RGM hhv. I tillegg, ved å bruke denne metoden vår gruppe har også vist at bare de gode regeneratorer viser en gjenvinning av ekspresjonen av neurofilaments etter skaden, og i løpet av regenereringen. Nylig, Busch og Morgan ⁷ har vist ved immunfluorescens at de dårlige regenerators viser en increased ekspresjon av synuclein etter skade, som har vært knyttet av forfatterne til det faktum at den "dårlige" regenerator spinal-neuroner som rager langsomt dø etter en fullstendig ryggmargstran ^5,7,8. Så har niøyemodell av et komplett ryggmargsskade dukket opp som en svært nyttig modell for å forstå hva som gjør en ryggmarg projisere nevron en "dårlig regenerator" etter axotomy.

For å gjennomføre våre studier vi utfører en komplett ryggmargstran kirurgi protokoll og en posterior hjernen disseksjon på de ønskede tidspunkter etter skade til å utføre wholemount in situ hybridisering. I den foreliggende metodiske artikkelen presenterer vi en detaljert protokoll for en forsvarlig saksbehandling i en komplett ryggmargsskade kirurgi i larve lampreys, den påfølgende vedlikehold av dyrene og den endelige hjernen disseksjon og forberedelse av hjernen for en wholemount in situ hybridisering. En detaljert protokoll til PErform den wholemount in situ hybridisering i hjernen av larver lampreys tidligere er blitt rapportert. ^9. I tillegg har denne protokoll for ryggmargsskade og hjerne disseksjon kan også brukes til å behandle deretter hjernene for immunohistokjemi eller andre histologiske metoder.

Protocol

Se tabell 1 for alle materialer som brukes i denne protokollen. Forsøkene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Temple University. 1. Dyr Skaff villtype larve sjøen lampreys (Petromyzon marinus L.), 10 – 14 cm i lengde (4 – 7 år) fra bekker fôring Lake Michigan, fra sideelver til Delaware River (Pennsylvania) eller bekker i Maine. I laboratoriet opprett larver i grupper på 50 – 100 dyr i …

Representative Results

Som et eksempel på hvilke resultater som kan oppnås ved bruk av denne metoden, representative bilder av wholemounted hjerner viser uttrykk for neogenin transkripsjoner i identifiserbare ryggmargs-projisere nevroner av kontroll og 2 uker etter lesjon larve sjøen lampreys er vist i figur 2. De leserne blir henvist til en tidligere studie 6 rapporterer forholdet mellom ekspresjonen av neogenin etter en fullstendig ryggmargstranseksjon og den regenererende evne til identifiserbare ryggmargs ra…

Discussion

Her presenterer vi en detaljert protokoll for å utføre en komplett ryggmargstran og posterior hjernen disseksjon i larve sjøen lampreys. Denne prosedyren kan analysere forskjeller i genuttrykk mellom identifiserbare ryggmargsutstikk nevroner etter ryggmargsskade ved hjelp av en hel-mount hjernen in situ hybridisering. Det kritiske trinnet i fremgangsmåten er den riktige utførelse av en komplett ryggmargstranseksjon, som kan styres ved å observere de kappede ender av ryggmargen under stereomicrocope og bekreftet 24…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Tricaine methane sulfonate	Spectrum	TR108	Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice
Scalpel #3	Fine Science Tools (FST)	10003-12
Blades for scalpel: #11	Fine Science Tools	10011-00
Castroviejo scissors #8	Fine Science Tools	15002-08
Forceps #4 & #5	Dumont, Switzerland	Roboz RS4955	#4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges
Dissecting Microscope	Olympus	SZ51
Sylgard	Dow Corning Co.	184
Insect pins 0.15, 0.20 mm	Austerlitz	No catalogue #	0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body
7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps	Fisher Scientific	03-337-1
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Science (EMS)	19210	Dilute to 4% in PBS