Electrospinning Growth Factor Releasing Microsfere in Fibrosi Ponteggi
Summary
This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.
Abstract
This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.
Introduction
Una delle sfide in corso in ingegneria dei tessuti neurali è la creazione di un condotto del nervo (NC) che imita la matrice extracellulare, dove i nervi crescono naturalmente. La ricerca ha dimostrato che le cellule rispondono a diversi fattori nel loro ambiente, tra cui meccanica, topografico, adesivi e segnali chimici 1-3. Una delle sfide principali in questo settore sta determinando la combinazione appropriata di segnali e fabbricando un sistema in grado di mantenere spunti per un lungo periodo per sostenere la crescita delle cellule 4. Neuroni periferici sono noti a preferire un substrato morbido, diretto da fibre allineate e rispondere agli fattore di crescita nervoso (NGF) 5-7. NC che può fornire segnali chimici per settimane hanno dimostrato di fornire una migliore recupero funzionale più vicina a quella di allotrapianti, il gold standard attuale per la riparazione dei nervi 8,9.
Materiali e metodi di produzione Diversi possono essere utilizzati per produrre meccanica e topograficoAl spunti 10-13. Spunti meccanici sono inerenti al materiale scelto, rendendo la selezione del materiale appropriato per l'applicazione critica 1,13. I metodi di produzione per il controllo spunti topografiche includono la separazione di fase, auto-assemblaggio e elettrospinning 1,13. Per le applicazioni microscala, microfluidica, photopatterning, incisione, liscivie sale, o schiume a gas può essere utilizzato anche 14-17. Electrospinning è emerso come il modo più popolare per progettare substrati fibrosi per coltura di tessuti grazie alla sua flessibilità e facilità di produzione 13,18-23. Nanofibre elettrofilate sono fabbricati applicando una tensione elevata ad una soluzione polimerica inducendolo a respingere se stessa e si estendono attraverso una breve distanza per scaricare 24. Un ponteggio allineato può essere creato raccogliendo le fibre su un mandrino rotante a terra e ponteggi non allineati sono raccolti su una piastra fissa 25. Segnalazione di adesione può essere ottenuto rivestendo il ponteggio spirito fibrosoh fibronectina o coniugare un peptide adesione, come RGD, per la prima HA elettrospinning 26.
Segnali chimici, come i fattori di crescita, sono i più difficili da mantenere per lunghi periodi perché hanno bisogno di una fonte per il rilascio controllato. Molti sistemi sono stati tentato di aggiungere rilascio controllato a reti fibrosi elettrofilate con vari livelli di successo. Questi metodi comprendono miscela elettrofilatura, emulsione elettrofilatura, core shell elettrofilatura e proteine coniugazione 27. Inoltre, elettrofilatura è tradizionalmente fatto in un solvente volatile, che può influenzare la vitalità della proteina 28, quindi mantenendo bioattività delle proteine deve essere considerato.
Questo approccio affronta specificamente che combina,, segnali chimici e adesivi topografici meccaniche per creare un'impalcatura sintonizzabile per la crescita dei nervi periferici. Meccanica impalcatura è controllata proprio dalla sintesimetacrilato acido ialuronico (HA). I siti methacrylation vengono utilizzati per collegare foto reticolanti reattivi. Il materiale reticolato non è solubile in acqua ed è suddiviso esclusivamente dagli enzimi 29. La quantità di reticolazione cambia la velocità di degradazione, meccanica ed altre proprietà fisiche del materiale. Utilizzo di HA con il 30% methacrylation, che ha un modulo di elasticità di ~ 500 Pa, crea un substrato morbido che è vicino alla meccanica nativi di tessuto neurale ed è in genere preferito dai neuroni 26,29. Electrospinning su un mandrino rotante viene utilizzato per creare fibre allineate per una stecca topografica. Utilizzando elettrofilatura con microsfere fornisce segnali chimici all'interno del ponteggio per periodi prolungati. Per supportare microsfere di crescita dei neuriti contenenti NGF sono utilizzati per creare il segnale chimico. Diversamente dalla maggior parte dei materiali elettrofilate HA è solubile in acqua in modo che il NGF non incontra solventi aggressivi durante la produzione. Per aggiungere un segnale di adesivo, la scaffold è rivestito con fibronectina. Il sistema completo contiene tutti e quattro i tipi di segnali sopra descritti: morbide (meccanici) allineati (topografiche) fibre con NGF rilascio microsfere (chimica) rivestito con fibronectina (adesivo). Produzione e collaudo di questo sistema è descritto in questo protocollo.
Il processo inizia con la produzione delle microsfere con acqua-in-olio-in-acqua doppia emulsione. L'emulsione è stabilizzato con un tensioattivo, alcool polivinilico (PVA). La fase acquosa interna contiene la proteina. Come è aggiunto alla fase olio, contenente il materiale delle coperture PLGA disciolto in diclorometano (DCM), il tensioattivo crea una barriera tra le fasi che proteggono la proteina dal DCM. Questa emulsione è più dispersa in un'altra fase acquosa contenente PVA per creare la superficie esterna delle microsfere. L'emulsione stabile viene agitata per consentire al DCM evaporare. Dopo il risciacquo e liofilizzazione si sono lasciati con la microsfere cont seccoaining proteina.
Dopo le microsfere sono completati sono pronti per essere elettrofilate in ponteggi. Per prima cosa preparate la soluzione electrospinning. La viscosità della soluzione è fondamentale per la formazione di fibre corretta. Soluzioni di puro HA non soddisfano questo requisito; PEO viene aggiunto come un polimero portante per consentire electrospinning. Le microsfere vengono aggiunti alla soluzione e elettrofilate conseguente un'impalcatura fibrosa con microsfere distribuiti.
Una volta che la produzione è completa, la proteina deve essere testato per verificarne la fattibilità. A tale scopo, una cellula primaria che risponde a NGF può essere utilizzato. Questo protocollo utilizza dei gangli dorsali (DRG) 8-10 giorni antichi embrioni di pollo. I fasci di cellule vengono seminate su scaffold contenenti microsfere riempite di NGF o quelli che sono vuoti. Se il NGF è ancora vitale si dovrebbe vedere una maggiore crescita dei neuriti sui ponteggi contenenti NGF. Se il NGF non è più praticabile lo faràNon promuovere neuriti per estendere e dovrebbe apparire simile al controllo.
La procedura esatta qui descritta è focalizzata sul sostegno neurale, però, con semplici modifiche al materiale, metodo elettrospinning e proteine del sistema può essere ottimizzato per i vari tipi di cellule e tessuti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Molti studi hanno dimostrato che le cellule nervose possono essere diretti da stimoli topografici (allineamento della fibra) e segnali chimici (fattori di crescita) 1,2,10,11,35. Electrospinning è un metodo facile per creare fibre allineate. I fattori di crescita favoriscono la crescita dei nervi, ma al fine di includerli in condotti nervose (NC), è necessario un metodo per rilascio prolungato. Per creare un sistema più robusto con entrambi i segnali, questi due segnali devono essere combinati. Diversi met…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded through the Richard Barber Foundation and a Thomas Rumble Fellowship (TJW).
Materials
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
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