Lifli iskelelerinin içine Microspheres ibra Elektroeğirme Büyüme Faktörü
Summary
This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.
Abstract
This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.
Introduction
Sinir doku mühendisliği devam eden zorluklardan biri sinirleri doğal olarak yetişen hücre dışı matris, taklit eden bir sinir kanalı (NC) yaratıyor. Araştırma hücreler, mekanik, topografik, yapışkan ve kimyasal sinyaller dahil olmak üzere 1-3 ortamında birçok faktöre yanıt göstermiştir. Bu alandaki başlıca sorunlardan biri, sinyallerin uygun kombinasyonunu belirlemek ve hücre büyümesini desteklemek için 4 uzun bir süre boyunca muhafaza ipuçlarını bir sistem imal edilir. Çevresel nöronlar yumuşak alt-tabakanın tercih ettikleri bilinmektedir hizalanır lifler tarafından yönlendirilebilir ve sinir büyüme faktörü (NGF) 5-7 yanıt. Hafta boyunca kimyasal ipuçları sağlayabilir NC'ler yakın allogreftlere, sinir onarımı 8,9 güncel altın standardın için geliştirilmiş fonksiyonel iyileşmeyi sağlamak için gösterilmiştir.
Malzemeler ve üretim yöntemleri, çeşitli mekanik ve topografik üretmek için kullanılabilirdiğerleri 10-13 işaret eder. Mekanik ipuçları 1,13 kritik uygulama için uygun malzeme seçimi yaparak, seçilen malzeme doğasında vardır. Üretim yöntemleri topografik ipuçları faz ayrılması, öz-montaj ve 1,13 electrospinning dahil kontrol etmek. Mikro uygulamalar, mikroflüidik, photopatterning, dağlama, tuz halindeki salamuralar, köpükler ya da gaz için, aynı zamanda 14-17 kullanılabilir. ELEKTROSPİNNİNG nedeniyle esneklik ve üretim 13,18-23 kolaylığı doku kültürü için elyaflı alt mühendisi en popüler yolu olarak ortaya çıkmıştır. Electrospun nanolifler kendini püskürtmek ve boşaltmak için 24, kısa bir aralık üzerinden germek için neden olan polimer solüsyonuna, bir yüksek voltaj uygulanarak imal edilmektedir. Bir hizalanmış iskele topraklanmış döner mandrel üzerine elyafların toplanması ile oluşturulabilir ve bağlantısız iskeleler ve durağan bir plaka 25 üzerinde toplanır. Yapışma sinyal elyaflı skafold wit kaplanması ile elde edilebilirs fibronektin veya 26 electrospinning önce HA gibi RGD gibi bir yapışma peptidi, konjuge.
Onlar kontrollü salım için bir kaynak gerekiyor çünkü bu tür büyüme faktörleri gibi kimyasal sinyalleri, uzun dönemler boyunca korumak için en zor. Birçok sistem başarı çeşitli düzeylerde ile electrospun lifli ağlara kontrollü salımını eklemek için denenmiştir. Bu yöntemler harman elektrospinning, emülsiyon elektrospinning, çekirdek-kabuk elektrospinning ve protein konjugasyon 27 içerir. Buna ek olarak, elektro geleneksel olarak bu nedenle proteinin biyo kabul edilmelidir muhafaza, proteinin 28 canlılığını etkileyebilen uçucu bir çözücü içinde yapılır.
Bu yaklaşım, özellikle periferik sinir büyüme için ayarlanabilir bir iskele oluşturmak için mekanik, topografik, kimyasal ve yapıştırıcı sinyalleri birleştirerek giderir. İskele mekanik tam sentetize edilmesi ile kontrol edilirMetakrilatlanmış Hyaluronik Asit (HA). Methacrylation siteleri fotoğraf reaktif crosslinkers bağlamak için kullanılır. Çapraz malzeme artık suda çözünür ve münhasıran enzimler 29 tarafından bozuldu. Çapraz bağlama miktarı degradasyon oranı, mekanik ve malzemenin diğer fiziksel özelliklerini değiştirir. ~ 500 Pa arasında bir gerilme modülüne sahiptir methacrylation% 30 ile HA kullanılarak, sinir dokusunun doğal mekanik yakındır ve tipik olarak nöronlar 26,29 tercih edilen yumuşak bir alt-tabakayı oluşturur. Dönen mandrel üzerinde Elektrospinning topografik bir işaret sağlayacak şekilde ayarlanır lifleri oluşturmak için kullanılır. Ile birlikte mikro-elektrospinning kullanma süreleri zarfında iskele içinde kimyasal sinyaller sağlar. Kimyasal sinyali oluşturmak için kullanılan NGF içeren nörit büyüme mikroküreler desteklemek için. NGF üretimi sırasında zorlu çözücüler karşılaşmasa bu yüzden çoğu electrospun malzemelerin aksine HA su içinde çözünür. SCA, yapışkan bir sinyali eklemek içinffold fibronektin ile kaplanır. NGF fibronektin (yapıştırıcı) ile kaplanmış mikroküreler (kimyasal) bırakmadan yumuşak (mekanik) hizalanmış (topografik) lifler: tamamlandı sisteminin yukarıda açıklanan sinyalleri dört türlerini içerir. Üretim ve bu sistemin test bu protokolü tarif edilmiştir.
Proses, bir su-içinde-yağ-içinde-su emülsiyonu ile çift mikrosferlerin üretimi ile başlar. Emülsiyon, bir yüzey aktif madde, polivinil alkol (PVA) ile stabilize edilir. İç su fazı protein içerir. Bu diklorometan (DCM) içinde çözüldü PLGA kabuk malzeme içeren, yağ fazına ilave edilir olarak, yüzey aktif madde DCM proteini koruyan fazlar arasında bir bariyer oluşturur. Bu emülsiyon, mikro kürelerin dış yüzeyini oluşturmak için polivinil alkol içeren bir su fazı içinde dağılmış daha uzundur. Kararlı bir emülsiyon, DCM buharlaşmasını sağlamak için karıştırılır. Durulama ve liyofılleme sonra kuru mikroküreler cont ile bırakılır, geri kalan proteini.
Mikroküreler tamamlandıktan sonra onlar iskelelerinin içine electrospun hazırdır. Öncelikle elektro solüsyon hazırlanır. Solüsyonun viskozitesi uygun elyaf formasyonu için çok önemlidir. Saf HA Çözümleri Bu zorunluluğa uymayan; PEO üretebilmektedir izin vermek için bir taşıyıcı polimer olarak ilave edilir. Bu mikrosferler, mikro-dağılmış olan elyaflı yapı iskeleti sonuçlanan çözeltisi ve electrospun eklenir.
Üretim işlemi tamamlandıktan sonra, protein, varlığını doğrulamak için test edilmelidir. Bunu yapmak için, NGF'ye tepki veren bir birincil hücre kullanılabilir. Bu protokol, 8-10 günlük tavuk embriyolarından sırt kök gangliyon (DRG) kullanır. Hücre demetleri NGF veya boş olanlar ile dolu küreleri içeren iskelelerinin üzerine ekilir. NGF hala canlı olup olmadığını NGF içeren iskelelerde gelişmiş akson büyümesini görmelisiniz. NGF artık geçerli değilse o olacakdeğil genişletmek için nevritlerle teşvik ve denetime benzer görünmelidir.
Burada tarif edilen prosedür, kesin malzeme basit değişiklikler, electrospinning yöntemi ve sistemi, çeşitli doku ve hücre tipleri için optimize edilebilir proteinleri ile, ancak, sinir destek üzerinde odaklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birçok çalışma, sinir hücreleri, topografik ipuçlarının (fiber hizalama) ve kimyasal uyaranlara (büyüme faktörleri) 1,2,10,11,35 yönettiği edilebileceğini göstermiştir. Elektro uyumlu lifleri oluşturmak için, basit bir yöntemdir. Büyüme faktörleri, sinir büyüme ancak sinir boruları (NC) içine dahil etmek için, uzun süreli salınımı için bir yöntem gereklidir ediyoruz. Her iki ipuçları ile daha sağlam bir sistem oluşturmak için, bu iki sinyal kombine edilmelidir. Çeşitli …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded through the Richard Barber Foundation and a Thomas Rumble Fellowship (TJW).
Materials
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
Referências
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
- Madigan, N. N., McMahon, S., O’Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
- Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
- Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
- Bronzino, J. D., Peterson, D. R. . The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition – 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , (2006).
- Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
- Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
- Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
- Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
- Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
- Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
- Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -. W. Electrospinning technology in tissue regeneration. Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).
- Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
- Han, D., Gouma, P. -. I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
- Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
- Yao, L., O’Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
- Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
- Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
- Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
- Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. . Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , (2003).
- Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
- Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
- Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
- Wang, C. -. Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
- Liu, J. -. J., Wang, C. -. Y., Wang, J. -. G., Ruan, H. -. J., Fan, C. -. Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).
